2012 Fiscal Year Annual Research Report
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24390070
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
宮園 浩平 東京大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (90209908)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 細胞医化学 / ゲノム医化学 / 細胞内シグナル伝達 / 発生医学 |
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| Research Abstract |
BMPシグナルは、マウスES細胞では自己複製能と多分化能維持に重要であることが報告されているが、プライムされた(primed)細胞と呼ばれるヒトES細胞やマウス胚盤葉上層幹細胞(EpiSC)では分化を促進する。本研究では、クロマチン免疫沈降-シークエンス法(ChIP-seq法)や全トランスクリプトーム解析(RNA-seq)を用いた解析を用い、細胞種依存的なBMPシグナルの分子機構と2つの幹細胞における差異を明らかにすることを目指して研究を行った。平成24年度は、以下の点を明らかにした。
1)Smad1/5のChIP-seqデータとBMP4刺激時のRNA-seqデータを取得し、マウスES細胞とマウスEpiSC様細胞の2つの幹細胞における、BMP4の直接の標的遺伝子を複数同定した。RNA-seq解析では、2つの幹細胞で特徴的に存在するスプライシングバリアントの有無も評価した。
2)2つの幹細胞における発現量の比較やSmad1/5結合領域に濃縮して存在するDNA結合配列より、核内受容体に属する転写因子に注目し、Smad1との直接の結合、レポーターアッセイによるSmad経路への影響を評価・確認した。今後、他の候補因子に関して同様のスクリーニングを行い、真に重要な因子の同定を目指す。
3)FLAG-Smad1安定発現株を利用し、抗FLAG抗体、抗Smad1/5抗体で順に免疫沈降することで、ES細胞でのSmad1/5結合蛋白を精製した。しかし、抗Smad1抗体に添加されたBSAの影響でMALDI-TOF/MS法では同定が困難だったことから、抗FLAG抗体、抗HA抗体で精製を行う方針として、FLAG-HA-Smad1安定発現株を樹立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ChIP-seq、RNA-seqのデータ取得や得られたデータの解析等、当初計画に沿っておおむね順調に進展している。
Smadl結合蛋白の同定に関しては、抗Smad1抗体に添加されたBSAの影響でMALDI-TOF/MS法で同定が困難だった。今後、抗体を変更することで対応する。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成25年度は、当初の計画通り推進する。研究計画の変更、研究遂行の上での課題は現時点ではない。上述の通り、Smad1結合蛋白の同定に関しては、抗Smad1抗体に添加されたBSAの影響でMALDI-TOF/MS法で同定が困難だった。今後、抗体を変更することで対応する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成24年度はChlP-seqやRNA-seqなどのデータを取得することが中心であったため、物品費が当初の予定より少なく抑えることができた。平成25年度は候補遺伝子のスクリーニングの継続とともに、これまで得られた候補遺伝子の機能解析などを行うことから物品費を多めに使用する予定である。
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