• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to project page

2013 Fiscal Year Annual Research Report

乳癌進展における微小環境シグナリングのリン酸化プロテオミクス解析と組織での可視化

Research Project

Project/Area Number 24390087
Research InstitutionMie University

Principal Investigator

吉田 利通  三重大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80166959)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 紅林 淳一  川崎医科大学, 医学部, 准教授 (10248255)
田中 典子 (花村 典子)  三重大学, 医学部附属病院, 講師 (60437100)
小塚 祐司  三重大学, 医学部附属病院, 講師 (50378311)
下條 尚志  三重大学, 医学部, 技術員 (70410751)
Project Period (FY) 2012-04-01 – 2015-03-31
Keywords乳癌 / 癌進展 / 微小環境 / プロテオミクス / リン酸化 / 癌幹細胞
Research Abstract

本年度では、テネイシン-C(TNC)とTGF-β添加後の細胞におけるリン酸化状態を、逆相タンパク質アレイ (RPPA)を用いて網羅的に検討を行った。Western blot法により、SRCとFAKのTyrリン酸化は処理により増強することを再確認したサンプルを用いたが、RPPA法ではリン酸化の増強が確認できなかった。Ser/Thrのリン酸化については、TGF-β添加でのリン酸化シグネチャとTNCやTNC+TGF-βのシグネチャは明らかに異なっており、後者ではPDK1、P70S6K、RSK2、cRAF、ELF4Gなどでリン酸化の増強がみられ、ERK1/2やRSK1は低下傾向にあった。その他にTyrリン酸化で、cMetのリン酸化の軽度亢進をみとめたのみであった。Tyrリン酸化は、Ser/Thrリン酸化に比較し、量的に少なくRPPA法では検出が困難であることが示唆された。
これらについて、Western blotで結果を検証したところ、cRAFとElf4Gのリン酸化の亢進は確認できた。また、ERAK1/2では逆の結果でリン酸化の亢進がみられた。これらのリン酸化タンパク質については、組織標本での検出を試みているところで、ERK1/2については培養細胞と癌細胞と間質細胞での発現が染色で観察できた。また、別の検討で、マクロファージについては、TNC処理により、NFkBのリン酸化と核移行が観察されることから、癌間質のマクロファージ(TAM)へポジティブな作用が考えられる。乳癌幹細胞については、フローサイトメトリで幹細胞リッチな分画を培養細胞の種類によっては十分量確保できることがわかったので、RPPA法とWestern blotでの解析を今後行う予定である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度から、TNC添加による擬似的な癌進展が進んだ細胞の網羅的リン酸化解析のため、RPPA法を行うことにした。このためにはかなり多量のTNCを必要とする。その精製を行っていたが、産生細胞が不調となり産生が少なく量がとれなくなった。そのため、産生細胞を新たに購入し、再度産生系を立て直す必要が生じた。また、精製機械が老朽化しており、故障が頻回に生じたため、装置の一部の入れ替えを行い、精製系も再構築を行った。この研究の根幹部分の不具合のため、実験の進行が遅れた。現在はいずれも回復し、来年度の実験に必要量のTNCは確保できている。

Strategy for Future Research Activity

1)ヒト乳癌組織内のTyrリン酸化のプロテオミクス解析、2)微小環境を再構成した培養細胞を用いたSer/Thrリン酸化と細胞機能との関連、3)ヒト乳癌組織内でのTyrおよびSer/Thrリン酸化シグナルの免疫組織化学による解析、4)癌幹細胞におけるリン酸化シグネチャの解析について以下の方法・方向性をもって研究を行う。
1)については採取されている試料をひとまず用いて、FAK/SrcなどのTyrリン酸化に絞って解析を行い、その結果を目標に網羅的な解析を試みる。さらに、前年度に行ったReverse Phase Protein Array (逆相タンパク質アレイ、RPPA) で差異がでたTyrリン酸化タンパク質についてもWestern blot法を用いて検討する。
2)については、培養細胞試料を用いて行ったRPPA法の結果でみられたTGF-betaやTNC処理後での変化をそれぞれのタンパク質について通常のWesternBlotでの解析をおこなう。また、間質を構成する細胞、特にマクロファージ、線維芽細胞についても検討を行う。これらのリン酸化タンパクの局在についても蛍光抗体法で観察を行う。
3)では、脱リン酸化を阻害した試料を用い、いくつかのリン酸化部位の検出に安定的に成功しているので、FAKとSRCのリン酸化について再び行っていく。ただし、これらのリン酸化の検出はリン酸化量が少ないと考えられ、RPPA法によって判明した下流と考えられる量的に多いSer/Thrリン酸化タンパクの免疫染色も試みる。
4)については、TNCが幹細胞プールを増加させ得るかを引き続き検討する。また、十分な細胞が確保する目途がついたので、RPPA法を用いて通常細胞と幹細胞の比較により、幹細胞に特異的なリン酸化シグネチャを明らかとする。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

前述したように、TNCの精製系の不具合により、研究に遅れが生じたため、次年度での解析に必要な経費を繰り越すことになった。
本研究において、現在の網羅的解析の主力となっているRPPA法による解析に用いる予定である。

  • Research Products

    (32 results)

All 2014 2013 Other

All Journal Article (21 results) (of which Peer Reviewed: 17 results,  Open Access: 1 results) Presentation (7 results) (of which Invited: 4 results) Book (3 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Tenascin C protects aorta from acute dissection in mice.2014

    • Author(s)
      Kimura T, Shiraishi K, Furusho A, Ito S, Hirakata S, Nishida N, Yoshimura K, Imanaka-Yoshida K, Yoshida T, Ikeda Y, Miyamoto T, Ueno T, Hamano K, Hiroe M, Aonuma K, Matsuzaki M, Imaizumi T, Aoki H.
    • Journal Title

      Sci Rep.

      Volume: 4 Pages: 4051

    • DOI

      10.1038/srep0405

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Tenascin-C causes neuronal apoptosis after subarachnoid hemorrhage in rats.2014

    • Author(s)
      Tenascin-C causes neuronal apoptosis after subarachnoid hemorrhage in rats. Shiba M, Fujimoto M, Imanaka-Yoshida K, Yoshida T, Taki W, Suzuki H.
    • Journal Title

      Transl Stroke Res.

      Volume: 5 Pages: 238-247

    • DOI

      10.1007/s12975-014-0333-2

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Antitumor and anticancer stem cell activity of a poly ADP-ribose polymerase inhibitor olaparib in breast cancer cells.2014

    • Author(s)
      Shimo T, Kurebayashi J, Kanomata N, Yamashita T, Kozuka Y, Moriya T, Sonoo H
    • Journal Title

      Breast Cancer

      Volume: 21 Pages: 75-85

    • DOI

      10.1007/s12282-012-0356-z

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Long-term outcome of hypofractionated radiotherapy to the whole breast of Japanese women after breast-conserving surgery.2014

    • Author(s)
      Ishihara T, Yoden E, Konishi K, Nagase N, Yoshida K, Kurebayashi J, Sonoo H, Murashima N, Sasaki R, Hiratsuka J
    • Journal Title

      Breast Cancer

      Volume: 21 Pages: 40-46

    • DOI

      10.1007/s12282-012-0345-2

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Prognostic value of phosphorylated HER2 in HER2-positive breast cancer patients treated with adjuvant trastuzumab.2014

    • Author(s)
      Kurebayashi J, Kanomata N, Yamashita T, Shimo T, Mizutoh A, Moriya T, Sonoo H.
    • Journal Title

      Breast Cancer

      Volume: 印刷中 Pages: 印刷中

    • DOI

      Not assigned

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Marked lymphovascular invasion, progesterone receptor negativity and high Ki67 labeling index predict a poor outcome in breast cancer patients treated with endocrine therapy alone.2014

    • Author(s)
      Kurebayashi J, Kanomata N, Shimo T, Yamashita T, Aogi K, Nishimura R, Shimizu C, Tsuda H, Moriya T, Sonoo H
    • Journal Title

      Breast Cancer

      Volume: 21 Pages: 214-222

    • DOI

      10.1007/s12282-012-0380-z

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Binding of αvβ1 and αvβ6 integrins to tenascin-C induces epithelial-mesenchymal transition-like change of breast cancer cells.2013

    • Author(s)
      Katoh D, Nagaharu K, Shimojo N, Hanamura N, Yamashita M, Kozuka Y, Imanaka-Yoshida K, Yoshida T.
    • Journal Title

      Oncogenesis.

      Volume: 2 Pages: -

    • DOI

      10.1038/oncsis.2013.27

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Preliminary study of serum tenascin-C levels as a diagnostic or prognostic biomarker of type B acute aortic dissection.2013

    • Author(s)
      Nozato T, Sato A, Hirose S, Hikita H, Takahashi A, Endo H, Imanaka-Yoshida K, Yoshida T, Aonuma K, Hiroe M.
    • Journal Title

      Int J Cardiol.

      Volume: 168 Pages: 4267-4269

    • DOI

      doi: 10.1016/j.ijcard.2013.04.211

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Tenascin-C induces prolonged constriction of cerebral arteries in rats.2013

    • Author(s)
      Fujimoto M, Suzuki H, Shiba M, Shimojo N, Imanaka-Yoshida K, Yoshida T, Kanamaru K, Matsushima S, Taki W.
    • Journal Title

      Neurobiol Dis.

      Volume: 55 Pages: 104-109

    • DOI

      10.1016/j.nbd.2013.01.007

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Atrial natriuretic peptide exerts protective action against angiotensin II-induced cardiac remodeling by attenuating inflammation via endothelin-1/endothelin receptor A cascade.2013

    • Author(s)
      Fujita S, Shimojo N, Terasaki F, Otsuka K, Hosotani N, Kohda Y, Tanaka T, Nishioka T, Yoshida T, Hiroe M, Kitaura Y, Ishizaka N, Imanaka-Yoshida K.
    • Journal Title

      Heart Vessels.

      Volume: 28 Pages: 646-657

    • DOI

      10.1007/s00380-012-0311-0

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Matricellular protein: a new player in cerebral vasospasm following subarachnoid hemorrhage.2013

    • Author(s)
      Suzuki H, Shiba M, Fujimoto M, Kawamura K, Nanpei M, Tekeuchi E, Matsushima S, Kanamaru K, Imanaka-Yoshida K, Yoshida T, Taki W.
    • Journal Title

      Acta Neurochir Suppl.

      Volume: 115 Pages: 213-218

    • DOI

      10.1007/978-3-7091-1192-5_39

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Aberrantly methylated genes in human papillary thyroid cancer and their association withBRAF/RASmutation.2013

    • Author(s)
      Kikuchi Y, Tsuji E, Yagi K, Matsusaka K, Tsuji S, Kurebayashi J, Ogawa T, Aburatani H, Kaneda A
    • Journal Title

      Front Genet

      Volume: 5 Pages: -

    • DOI

      10.3389/fgene.2013.00271

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 乳がんのサブタイプ分類とゲノミクス.2013

    • Author(s)
      紅林淳一
    • Journal Title

      クリニシアン

      Volume: 622 Pages: 82-87

  • [Journal Article] ホルモン療法耐性・HER2陰性乳がんに対する薬物治療の実際 1)ホルモン療法2013

    • Author(s)
      紅林淳一
    • Journal Title

      臨床腫瘍プラクティス

      Volume: 9 Pages: 362-366

  • [Journal Article] ホルモン感受性と抵抗性の予測因子2013

    • Author(s)
      紅林淳一
    • Journal Title

      癌と化学療法

      Volume: 40 Pages: 2500-2504

  • [Journal Article] エストロゲン受容体陽性乳癌細胞における抗エストロゲン薬とmTOR阻害薬エベロリムスの細胞増殖及び癌幹細胞制御に対する効果2013

    • Author(s)
      山下哲正、紅林淳一、鹿股直樹、下登志朗、森谷卓也、園尾博司
    • Journal Title

      川崎医学会誌

      Volume: 39 Pages: 65-79

  • [Journal Article] 両側上部領域乳癌に対し真皮脂肪乳腺弁を用いて乳房形成を行った1例2013

    • Author(s)
      小川朋子、花村典子、山下雅子、伊藤みのり、木村弘子
    • Journal Title

      乳癌の臨床

      Volume: 28 Pages: 435-439

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Modified round block techniqueとabdominal advancement flapを組み合わせたoncoplastic surgeryを施行した1例2013

    • Author(s)
      小川朋子、花村典子、山下雅子、伊藤みのり、木村弘子
    • Journal Title

      乳癌の臨床

      Volume: 28 Pages: 535-540

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 7.5cmの単発肝転移を伴ったT1a乳癌の1例2013

    • Author(s)
      木村弘子、小川朋子、山下雅子、花村典子
    • Journal Title

      乳癌の臨床

      Volume: 28 Pages: 337-343

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] ステレオガイド下マンモトーム生検の検討 画像の診断精度と経過観察方針について2013

    • Author(s)
      稲上馨子、花村典子、山下雅子、木村弘子、小川朋子
    • Journal Title

      日本乳癌検診学会

      Volume: 22 Pages: 317-322

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Racquet mammoplastyとabdominal advancement flapを組み合わせたoncoplastic surgery2013

    • Author(s)
      小川朋子、花村典子、山下雅子、伊藤みのり、木村弘子
    • Journal Title

      乳癌の臨床

      Volume: 28 Pages: 207-212

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] テネイシンCからのインテグリンシグナリング2013

    • Author(s)
      吉田利通
    • Organizer
      第45回日本結合組織学会学術大会 第60回マトリックス研究会大会 合同学術大会
    • Place of Presentation
      和歌山
    • Year and Date
      20130628-20130629
    • Invited
  • [Presentation] 背部有茎穿通枝皮弁を用いた乳房再建術2013

    • Author(s)
      花村典子、山下雅子、伊藤みのり、木村弘子、小川朋子
    • Organizer
      日本乳癌学会
    • Place of Presentation
      浜松
    • Year and Date
      20130627-20130629
  • [Presentation] テネイシン-Cはインテグリンαvβ1/6を介して上皮間葉移行を誘導する2013

    • Author(s)
      吉田利通、下條直志、今中-吉田恭子
    • Organizer
      第102回日本病理学会総会
    • Place of Presentation
      札幌
    • Year and Date
      20130606-20130608
  • [Presentation] 乳房温存手術における整容性を向上させる手技 NAC-recentralization2013

    • Author(s)
      花村典子、山下雅子、伊藤みのり、木村弘子、小川朋子
    • Organizer
      日本外科学会
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      20130411-20130413
  • [Presentation] Biological markers: as guidance for clinical decision in breast cancer treatment and their limits

    • Author(s)
      Junichi Kurebayashi
    • Organizer
      Eisai Symposium of Contemporary Oncology
    • Place of Presentation
      Jeju, Korea
    • Invited
  • [Presentation] 乳癌に対する薬物療法の最新情報.

    • Author(s)
      紅林淳一
    • Organizer
      第36回岡山県病院薬剤師会癌薬物療法研究会
    • Place of Presentation
      岡山
    • Invited
  • [Presentation] 乳癌の内分泌療法

    • Author(s)
      紅林淳一
    • Organizer
      第1回Breast Cancer Board Japan会議
    • Place of Presentation
      大阪
    • Invited
  • [Book] ファーマナビゲーター SERM編2013

    • Author(s)
      紅林淳一
    • Total Pages
      10
    • Publisher
      メディカルレビュー社 10
  • [Book] これからの乳癌診療2013-20142013

    • Author(s)
      紅林淳一
    • Total Pages
      8
    • Publisher
      金原出版株式会社
  • [Book] オンコロジー・クリニカルガイド乳癌薬物療法2013

    • Author(s)
      紅林淳一
    • Total Pages
      10
    • Publisher
      南山堂
  • [Remarks] 基礎医学系講座│修復再生病理学分野

    • URL

      http://www.medic.mie-u.ac.jp/organization/course/pathol_matrix/

URL: 

Published: 2015-05-28   Modified: 2015-06-16  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi