2012 Fiscal Year Annual Research Report
次世代シークエンサーを用いたGM-CSF自己抗体産生機序の解明
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24390208
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
中田 光 新潟大学, 医歯学総合病院, 教授 (80207802)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田澤 立之 新潟大学, 医歯学総合病院, 講師 (70301041)
中垣 和英 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 准教授 (90143635)
井上 義一 独立行政法人国立病院機構近畿中央胸部疾患センター, 臨床研究センター, 部長 (90240895)
根井 貴仁 日本医科大学, 医学部, 助教 (30597670)
横崎 恭之 広島大学, 保健管理センター, 准教授 (80210607)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 肺胞蛋白症 / 抗GM-CSF自己抗体 / 抗体H鎖可変部 / 次世代シークエンス |
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| Research Abstract |
研究の目的:IgG型自己抗体が自己免疫性肺胞蛋白症の病因であり、その産生亢進の原因を突き止めることが本研究の狙いである。次世代シークエンサーの活用によりGM-CSF自己抗体をB細胞受容体にもつ抗体H鎖、L鎖可変領域のmRNA遺伝子配列の解析から、利用レパトアのプロファイリングと体細胞突然変異の頻度を患者と健常者の間で比較し、結合親和性と中和能が高いIgG抗体が産生される機構を解明する。
研究実施計画:新潟大学医学部遺伝子倫理委員会の承認を得て、健常者、自己免疫性肺胞蛋白症患者5人ずつより末梢血を採取し、抗体重鎖、軽鎖mRNA配列の一挙解読を行い、(1)CDR1/2の配列から体細胞突然変異の頻度、(2)CDR3の配列からパラトープの解析を行った。
結果 : 末梢血PBMCより、ビオチン化GM-CSFを用いて膜型GM-CSF自己抗体陽性B細胞をソートし、RNA抽出し、cDNAを作製した。次にcDNAをtemplateとして、抗体重鎖可変部のPCRampliconを被験者毎に得て、定量し、次世代シークエンスにかけた。患者5人から54970 reads、健常者5人から68213 readsのシークエンスが得られ、ソフトIMGTにかけたところ、IgG : 患者6480 reads 健常者3331 reads IgM : 患者40593 reads 健常者19273 reads、つまり、IgM型とIgG型の割合は、患者、健常者ともに6:1であり、頻度は変わらないことがわかった。シークエンスをIgM型とIgG型の間、また、患者と健常者の間で比較したところ、患者、健常者ともにIgG型とIgM型のシークエンスには顕著な差がみられる。CDR1,2の変異率はIgGが圧倒的に高い。患者、健常者ともにほぼ等しい割合で、IgG型とIgM型のシークエンスを持つ。IgG型とIgM型はことなるgermline alleleの組み合わせを使っていることがわかった。患者と健常者の間には、超可変部CDR1,2,3の差がみられなかった。・IgG型自己抗体で、J領域のアミノ酸数が患者の方が健常者よりも優位に多かった。これは、体細胞超変異のためではなく、選択されるJ領域のgermline alleleの種類が異なるためであることがわかった。などの所見がみられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
バイオインフォマティクスのソフトIMGTを活用でき、それにより、GM-CSF自己抗体重鎖のアリル解析、各領域の変異解析、CDR3領域のパラトープ解析が容易になった。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在は患者5人、健常者5人のみの配列解析であるが、それをさらに10～15人ずつ増やすことで、より精密な解析をめざす。また、患者をさらに20名解析することで、パラトープと重症度との関連を明らかにしていきたい。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
次年度に次世代シークエンサーの解析を行う。
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[Journal Article] IgM-type GM-CSF autoantibody is etiologically a bystander but associated with IgG-type autoantibody production in autoimmune pulmonary alveolar proteinosis.2012
Author(s)
Nei T, Urano S, Motoi N, Takizawa J, Kaneko C, Kanazawa H, Tazawa R, Nakagaki K, Akagawa KS, Akasaka K, Ichiwata T, Azuma A, Nakata K.
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Journal Title
Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.
Volume: 302(9)
Pages: 1959-1964
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Runx1 deficiency in CD4+ T cells causes fatal autoimmune inflammatory lung disease due to spontaneous hyperactivation of cells.2012
Author(s)
Wong WF, Kohu K, Nakamura A, Ebina M, Kikuchi T, Tazawa R, Tanaka K, Kon S, Funaki T, Sugahara-Tobinai A, Looi CY, Endo S, Funayama R, Kurokawa M, Habu S, Ishii N, Fukumoto M, Nakata K, Takai T, Satake M.
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Journal Title
J Immunol.
Volume: 188(11)
Pages: 5408-5420
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Pulmonary Alveolar Proteinosis (PAP) And Inhaled Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) Therapy-Clinical Features Predicting Recurrence.2012
Author(s)
R. Tazawa, T. Arai, T. Takada, Y. Kasahara, Y. Tsuchihashi, T. Nei, M. Hojo, H. Nakayama, M. Yokoba, H. Ishii, R. Eda, Y. Nasuhara, M. Ebina, M. Akira, E. Yamaguchi, Y. Inoue, K. Nakata.
Organizer
Meet The Professor Meeting.
Place of Presentation
ドイツ(招待講演)
Year and Date
2012-06-23
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[Book] 大学病院などの再生医療を支える細胞プロセッシング室運営マニュアル2012
Author(s)
井上典子, 梶正美, 小神晴美, 渡辺真理, 関根優, 白山早起, 藤本陽子, 瀧澤淳, 牧口智夫, 布施一郎, 中田光
Total Pages
142
Publisher
株式会社ウイネット
