神経筋接合部の正常構築と分子病態研究

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24390221
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 大野 欽司 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80397455)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 増田 章男 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (10343203) ; 伊藤 美佳子 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60444402) ; 大河原 美静 名古屋大学, 高等研究院, 特任講師 (80589606)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 先天性筋無力症候群 / 神経筋接合部 / RSPO2 / LGR5 / Wnt

Research Abstract

Wntが胎生期におけるアセチルコリン受容体(AChR)のクラスタリングに重要であることが知られてきたがそのシグナル伝達機構は十分に解明されていない。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション法によりマウス脊髄前角細胞を単離しマイクロアレイ解析ならびにRNA-seq解析により網羅的な遺伝子発現を調べた。脊髄後角領域細胞をコントロールとした。脊髄前角細胞特異的に発現する複数の遺伝子のなかで、Wntシグナルを制御することが知られている細胞外分泌タンパクRspo2に着目して解析を行った。C2C12筋芽細胞に対するRspo2の付加ならびにsiRNAによるRspo2のノックダウン、並びに、Rspo2ノックアウトマウスの解析にてRspo2はWntを介するAChRクラスタリングに必須の分子であり、agrinの80%のAChRクラスタリング活性を有することが判明した。3種類のWnt受容体分子、MuSK/LRP4, LRP5/6, Frizzled/LGR5のそれぞれのノックダウン実験により、LGR5がRspo2の受容体として機能をすることを解明した。本研究はRspo2がagrinに次ぐ脊髄前角細胞が産生するAChRクラスタリング誘導因子であることを明らかにした。先天性筋無力症候群のexome capture resequencingデータ解析においてRSPO2とLGR5を候補遺伝子として解析を行い複数のsingle nucleotide variations (SNVs)を同定したが、いずれもdbSNPに登録されており正常SNPと判断をした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マウス脊髄前角細胞のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション法により前角細胞特異的に発現をする遺伝子群の同定から開始をして、agrinに次ぐ重要な脊髄前角細胞由来細胞外分泌タンパクを同定することができた。同時にその受容体がLGR5であることを同定した。先天性筋無力症候群における候補遺伝子を増やすことを目的として本研究を進めてきたが、現在までのところRSPO2とLGR5に候補遺伝子変異を同定できていない。

Strategy for Future Research Activity

先天性筋無力症候群のexome capture resequencing解析をさらに多くの症例で行い、原因遺伝子の同定を進める。脊髄前角細胞特異的に発現をする遺伝子群には他にも複数の興味深い遺伝子があり、その予備的な機能解析ではAChRクラスタリングに重要なさらに複数の分子が存在をすることが期待をされ、これらの分子の解析をさらに進める。

Research Products

• [Journal Article] LRP4 third beta-propeller domain mutations cause novel congenital myasthenia by compromising agrin-mediated MuSK signaling in a position-specific manner (2014)
  • Author(s): Ohkawara B, Cabrera-Serrano M, Nakata T, Milone M, Asai N, Ito K, Ito M, Masuda A, Ito Y, Engel AG, Ohno K.
  • Journal Title: Hum Mol Genet Volume: 23 Pages: 1856-1868
  • DOI: 10.1093/hmg/ddt578
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clinical and genetic analysis of the first known Asian family with myotonic dystrophy type 2 (2014)
  • Author(s): Nakayama T, Nakamura H, Oya Y, Kimura T, Imahuku I, Ohno K, Nishino I, Abe K, Matsuura T.
  • Journal Title: J Hum Genet Volume: 59 Pages: 129-133
  • DOI: 10.1038/jhg.2013.133
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Kir3.4 mutation causes Andersen-Tawil syndrome by an inhibitory effect on Kir2.1 (2014)
  • Author(s): Kokunai Y, Nakata T, Furuta M, Sakata S, Kimura H, Aiba T, Yoshinaga M, Osaki Y, Nakamori M, Itoh H, Sato T, Kubota T, Kadota K, Shindo K, Mochizuki H, Shimizu W, Horie M, Okamura Y, Ohno K, Takahashi M.
  • Journal Title: Neurology Volume: 82 Pages: 1058-1064
  • DOI: 10.1212/WNL.0000000000000239
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Exome sequencing of senescence-accelerated mice (sam) reveals deleterious mutations in degenerative disease-causing genes (2013)
  • Author(s): Tanisawa K, Mikami E, Fuku N, Honda Y, Honda S, Ohsawa I, Ito M, Endo S, Ihara K, Ohno K, Kishimoto Y, Ishigami A, Maruyama N, Sawabe M, Iseki H, Okazaki Y, Hasegawa-Ishii S, Takei S, Shimada A, Hosokawa M, Mori M, Higuchi K, Takeda T, Higuchi M, Tanaka M.
  • Journal Title: BMC Genomics Volume: 14 Pages: 248
  • DOI: 10.1186/1471-2164-14-248
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mutations in the C-terminal domain of ColQ in endplate acetylcholinesterase deficiency compromise ColQ-MuSK interaction (2013)
  • Author(s): Nakata T, Ito M, Azuma Y, Otsuka K, Noguchi Y, Komaki H, Okumura A, Shiraishi K, Masuda A, Natsume J, Kojima S, Ohno K.
  • Journal Title: Hum Mutat Volume: 34 Pages: 997-1004
  • DOI: 10.1002/humu.22325
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Gfpt1-myasthenia: Clinical, structural, and electrophysiologic heterogeneity (2013)
  • Author(s): Selcen D, Shen XM, Milone M, Brengman J, Ohno K, Deymeer F, Finkel R, Rowin J, Engel AG.
  • Journal Title: Neurology Volume: 81 Pages: 378
  • DOI: 10.1212/WNL.0b013e31829c5e9c
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] HnRNP L and hnRNP LL antagonistically modulate PTB-mediated splicing suppression of CHRNA1 pre-mRNA (2013)
  • Author(s): Rahman MA, Masuda A, Ohe K, Ito M, Hutchinson DO, Mayeda A, Engel AG, Ohno K.
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 3 Pages: 2931
  • DOI: 10.1038/srep02931
  • Peer Reviewed
• [Presentation] R-spondin2 is crucial for neuromuscular junction formation (2013)
  • Author(s): Nakashima H, Ohkawara B, Imagama S, Ito Z, Ishiguro N, Ohno K
  • Organizer: 43rd Annual Meeting, Society for Neuroscience (Poster)
  • Place of Presentation: San Diego, USA
  • Year and Date: 20131113-20131113
• [Presentation] Mutations in LRP4 in congenital myasthenia reveal position-specific regulations of agrin and Wnt signaling of LPR4 (2013)
  • Author(s): Ohkawara B, Cabrera M, Nakata T, Shen X, Ito Y, Engel AG, Ohno K
  • Organizer: 43rd Annual Meeting, Society for Neuroscience (Poster)
  • Place of Presentation: San Diego, USA
  • Year and Date: 20131113-20131113
• [Presentation] Mutations in the third β-propeller domain of LRP4 in congenital myasthenia compromise agrin-mediated MuSK signaling in a position-specific manner (2013)
  • Author(s): Ohkawara B, Cabrera M, Nakata T, Milone M, Ito Y, Engel AG, Ohno K
  • Organizer: 36th Annual Meeting of the Japan Neuroscience Society (Poster)
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館(京都市)
  • Year and Date: 20130622-20130622
• [Presentation] Collagen Q is a key player for developing rational therapy for congenital myasthenia and for causing anti-MuSK myasthenia gravis (2013)
  • Author(s): Ohno K, Ito M, Kawakami Y, Ohtsuka K, Krejci E.
  • Organizer: XIV International Symposium on Cholinergic Mechanisms (Platform)
  • Place of Presentation: Hangzhou, China
  • Year and Date: 20130505-20130509
  • Invited
• [Book] "Collagen Q is a key player for developing rational therapy for congenital myasthenia and for dissecting the mechanisms of anti-MuSK myasthenia gravis" in J Mol Neurosci (2014)
  • Author(s): Ohno K, Ito M, Kawakami Y.
  • Total Pages: Epub ahead of print
  • Publisher: Springer, New York
• [Book] "Molecular Genetics of Congenital Myasthenic Syndromes" in eLS (2014)
  • Author(s): Ohno K, Ohkawara B, Ito M, Engel AG.
  • Total Pages: in press
  • Publisher: John Wiley & Sons, Inc., Hoboken
• [Book] "Specific binding of collagen Q to the neuromuscular junction is exploited to cure congenital myasthenia and to explore bases of myasthenia gravis" in Chem Biol Interact 203(1) (2013)
  • Author(s): Ohno K, Ito M, Kawakami Y, Krejci E, Engel AG.
  • Total Pages: 376(335-340)
  • Publisher: Elsevier, Amsterdam