2014 Fiscal Year Annual Research Report
乳癌の血管内皮増殖因子関連マイクロＲＮＡの同定と抗ＶＥＧＦ療法感受性予測への応用
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24390301
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
佐藤 史顕 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20467426)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
戸井 雅和 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10207516)
佐治 重衡 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80446567)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 乳癌 / 血管新生 / bevacizumab / microRNA / VEGF / NRP1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１.VEGF-NRP1依存性のmiRの同定
平成２４年度に乳癌細胞株２５株と正常内皮細胞でのVEGFA, VEGFR1/2, NRP1/2の発現をRTPCR法で確認したところ、乳癌細胞株ではVEGFの受容体のVEGFR1/2の発現が内皮細胞に比較して格段に少ないか発現しておらず、NRP1/2は同等の発現をした細胞株もあった。そこでVEGFのauto/paracrineでのシグナルの流入口としてNRP1を想定してNRP1のloss of function実験を行った。VEGFとNRP1発現陽性のMDAMB231に対してshRNAをレンチウィルスで導入した細胞を作製した。RT-PCRにてNRP1発現が80％減弱された細胞を２株樹立した。この２株のVEGF発現が異なり、またmicroRNA発現プロファイルでもbevacizumab投与群と非投与群で有意なmicroRNAの変化が認められなかった。
２. miRBaseバージョン17を使用したmiR発現プロファイルの取得
今までのmicroRNAの発現プロファイルはmiRBaseバージョン14を使用したものであるが、microRNAをより網羅的に解析するためと、より再現性を高めるためにMDA-MB-231細胞にbevacizumabを投与した実験を複数回繰り返し、その標本からmicroRNAプロファイルを取得した。そこから、bevacizumab投与により発現増加するものとしてmiR-29c, 128, 138, 371a, 494 減少するものとしてlet-7 family, miR-30 family, 23b, 27b, 93, 99a/b, 100, 106b, 107 125a, 222がリストアップされた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2014年度当初は、乳癌細胞が発現したVEGFAがその癌細胞にparacrine, autocrineするにあたり、VEGFR1/2の発現が非常に低い為、NRP1を受容体としてシグナルが伝達されるという仮説をたてて実験を計画した。実際はNRP1はVEGFA以外のリガンドが数種類あり、NRP1をノックダウンした際、VEGFAを中和した以上の表現型がでてしまい、VEGFA-NRP1のシグナルの下流にあるmiRが絞り込めなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成2014年度までにスクリーニングされリストアップされたmicroRNAに関して、それらの発現を検証するとともに、以下の生物学的phenotypeとの因果関係のあるを探索する。
１、 乳癌細胞のPaclitaxel治療におけるbevacizumabの効果と関連microRNA探索：臨床ではbevacizumabを使用する場合、paclitaxelとの併用が行われている。この状況でのbevacizumabの効果は血流の正常化によるpaclitaxel濃度の上昇という説明が一般的であるが、乳癌細胞への直接の影響もあるという仮説をたて検索する。具体的には、乳癌細胞株へのpaclitaxelのIC50、細胞周期、アポトーシスに関してbevacizumab投与群と非投与群で比較する。また、その差に関連するmicroRNAの標的分子を探索する。
２、乳癌細胞の分泌するサイトカインに対するbevacizumabの効果と関連microRNA探索：最近、癌細胞周囲の微小環境における、血管新生と免疫機能との関係が注目されている。癌治療においてbevacizumab投与がサイトカインに対する影響を調べ、そこにmicroRNAによる制御があるかを探索する。サイトカイン測定にはRT-PCR法とbio-plex法を用いる。
３、乳癌細胞が分泌するexosome内microRNAとbecacizumabの効果：近年、癌細胞が周囲の微小環境を変化させる方法として、exosomeを分泌することが判ってきている。exosome内のmicroRNA発現パターンは癌細胞内の発現パターンとは異なることも分かっている。exosome内のmicroRNA発現パターンがbevacizumab投与により影響を受けるかどうかを調べる。またそれが、癌組織内の内皮、線維芽細胞、免疫細胞にどのような影響を及ぼしているかも調べる。
４、１～３で同定されたmiRに対する標的遺伝子の同定：miR標的分子予測アルゴリズムで２）で認められたmiRの機能に合致する標的分子を探索する。その分子の3’UTRのレポーターベクターを作製してmiRと標的分子の3’UTRの相互作用を証明する。
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| Causes of Carryover |
研究がやや遅れを生じていて、microRNAの機能解析が行えなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本年の研究計画にも記載したが、bevacizumab投与における乳癌細胞のphenotypeの変化と、それに関与するmicroRNAの機能解析に使用する計画である。
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Research Products
(4 results)
