2012 Fiscal Year Annual Research Report
視床皮質ニューロンのトランスクリプトーム解析による吸入麻酔薬の作用機序の解明
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24390366
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
山蔭 道明 札幌医科大学, 医学部, 教授 (70285005)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉野 繁一 札幌医科大学, 医学部, 助教 (00423765)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 麻酔科学 |
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| Research Abstract |
吸入麻酔薬の作用機序の一つとして近年視床一大脳皮質問の神経ネットワークが注目されている。そのうち主な役割を担う視床皮質(TC)ニューロンに特異的な遺伝子発現プロファイルがあると予測される。そこでTCニューロンのトランスクリプトーム解析により、吸入麻酔薬の細胞内遺伝子発現レベルでの作用機序を解明する。計画している具体的な研究項目は1.マウスTCニューロンのトランスクリプトーム解析、2.麻酔薬曝露により発現の変化するmRNAの探索とそれをノックダウンするmiRNAの作製、3.さまざまな臨床状況を想定したノックダウンマウスの疾患モデルの検討、4.エクソーム解析への進展と手術患者での検証、の4つである。
平成24年度、申請者らはマウスの脳をNeuN染色した後に、Laser Microdissection (MMI cell cut plus、学内備品)を用いて特定ニューロンよりトータルRNAを抽出する実験系を確立した。さらに得られたトータルRNAはmRNAを抽出した後にcDNAに変換し、〓〓CT法によってmRNAの発現量を定量する実験系を確立した。
また次世代半導体シーケンサ、Ion PGMシーケンサ(学内備品)により臨床検体を用いてDNAシーケンスを実施中である。本研究を通じて臨床的な静脈麻酔薬および吸入麻酔薬とSEF95の個体差の原因遺伝子を検出し、さらに動物実験を通じてtranscription-wide gene profilingを行う予定である。また本研究を通じ、GABA受容体関連遺伝子の一部の遺伝子多型が静脈麻酔薬の就眠濃度の個体差と関係することを新たに発見した(米国麻酔科学会で発表)。
安定してIon PGMシーケンサの稼働が可能となれば、安価にtranscription-wide geneprofilingが可能となり、本研究の実現性は高いと考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度の平成24年度、患者臨床検体を用いて吸入麻酔薬の就眠濃度およびその際のSEF95と、NGSを用いたGABA受容体関連遺伝子群との遺伝子多型解析を行った。同時にマウスの脳の神経核よりニューロンを単離し、mRNAの発現をRTPCR(〓〓CT法)により定量する実験系を確立した。この二つの実験系を組み合わせることにより、当初の目的であったトランスクリプトーム解析を行うことは可能であると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
マウスTCニューロンのトランスクリプトーム解析
C57/BL6マウスにデスフルランを4-7%で6時間投与し、脳スライスよりレーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)を用いてTCニューロンで構成される視床外側腹側核(VPD、後内側腹側核(VPM)からニューロンを単離し、トータルRNAを抽出する。次世代半導体シークエンサIon Torrentを用いてwhole RNAシークエンスを行うことにより、吸入麻酔薬曝露前後でのVPL、VPMにおけるmRNAの発現量変化を全てのmRNAに対して行う。吸入麻酔薬曝露前後でVPL、VPMにおいて発現量の変化の認められたmRNAに対して、in silicoにBlock-iTプログラムを用いてmiRNAを作製する。個々のmiRNAに対してRNA干渉によるノックダウンマウスを作製し、リアルタイムPCRによるmRNA発現の減少、免疫組織染色とウエスタンブロットによる蛋白産生低下を確認する。
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