2013 Fiscal Year Annual Research Report
超微構造解析から探るＤＭＰ１による生体内石灰化機構の解明
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24390409
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
豊澤 悟 大阪大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (30243249)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
保田 英洋 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (60210259)
三浦 治郎 大阪大学, 歯学部附属病院, 助教 (70437383)
石本 卓也 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (50508835)
佐伯 万騎男 新潟大学, 医歯学系, 教授 (30273692)
宇佐美 悠 大阪大学, 歯学部附属病院, 助教 (80444579)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 生体内石灰化 / dentin matrix protein 1 / 翻訳後修飾 / 超微構造 / 骨細胞 |
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| Research Abstract |
骨の非コラーゲン性基質蛋白質であるDMP1(dentin matrix protein 1)は、骨芽細胞では産生されず、骨基質に埋まった骨細胞により特異的に産生される。骨細胞から産生されたDMP1 は、分泌後に高度なマイナス荷電体となり、強力なCa2+結合能を獲得して骨の石灰化に関与すると考えられている。その過程で、DMP1 は様々な翻訳後修飾（①プロテオグリカン結合、②37kDa 断片と57kDa 断片への切断、③カゼインキナーゼによるリン酸化）を受けると報告されているが、DMP1 の翻訳後修飾と骨の石灰化との関係は明らかではない。本研究では、DMP1 の翻訳後修飾という蛋白分子レベルの微小現象が骨の石灰化に果たす役割を、超微構造解析により明らかにする。
H25年度は、DMP1の翻訳後修飾であるリン酸化の検討を脱灰骨組織切片の蛍光2重免疫染色により検討した。37kDaのN端断片と57kDaのC端断片を捉える抗体を用いて検討した結果、N端断片は骨小腔周囲基質に分布するのに対し、C端断片は骨細管周囲の基質に分布することが明確になった。次に、生化学的解析により高度にリン酸化されていると報告のある57kDaのC端断片のリン酸化状態を、リン酸化Serを認識する抗体と57kDaのC端断片を認識する抗体の蛍光2重免疫染色を用いて検討した所、リン酸化Serの免疫反応はC端断片の局在部位に重なり、骨細管周囲に分布するC端断片は高度にリン酸化されていることが分かった。最近、分泌蛋白質をリン酸化するFam20Cが発見され、in vitroではDMP1をリン酸化することが報告された事から、Fam20Cの免疫染色を行った結果、Fam20Cは骨細胞に高発現していることが分かった。従って、骨細胞が特異的に産生するDMP1は、同様に、骨細胞が高発現するFam20C によりリン酸化されることが推測された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
(理由）リン酸化Serを捉える抗体を探して検討するのに時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
翻訳後修飾を捉える抗体は、プロテオグリカンを捉える抗体以外はほぼ揃ったので、免疫電顕に取りかかっている。まず、包埋する樹脂を検討し、抗原の維持が可能かどうかの検討をして包埋樹脂の検討をおこない、コロイドゴールドを用いた免疫電顕にて、DMP1の翻訳後修飾の超微構造を検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
今年度に使用予定であった培養細胞への遺伝子導入実験がベクター構築の段階で遅れており、導入ベクターや遺伝子導入試薬をまだ購入していないため。
培養細胞への遺伝子導入用ベクター構築と遺伝子導入試薬に使用する。
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Research Products
(2 results)
