2012 Fiscal Year Annual Research Report

アポトーシスおよび非アポトーシス細胞死機序におけるｃＰＬＡ２の関与について

Research Project

Project/Area Number	24390421
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Research Institution	Nagasaki University
Principal Investigator	中村卓長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (30172406)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	角美佐長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (90284702) 佛坂由可長崎大学, 大学病院, 講師 (10244089) 角忠輝長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (80284701) 佐々木美穂長崎大学, 大学病院, 助教 (10437874) 片山郁夫長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (80295089) 田代茂樹長崎大学, 大学病院, 助教 (20300882) 市川陽子長崎大学, 大学病院, 助教 (90380857)
Project Period (FY)	2012-04-01 – 2015-03-31
Keywords	cPLA2 / knock-outマウス
Research Abstract	平成２４年度はcPLA2 conditional knock-out マウスの確立を目標とした。この年度内にcPLA2 conditional knock-out マウスを確立し、次年度からの研究利用を可能にする。これまで確立されたcPLA2 knock-out マウスは不妊を伴うため、ヘテロで維持をする必要があり、したがって生まれた仔のgenotypeをSouthern blottingにてそのつど確認する膨大な作業が必要であった。ために供給量に難点があったことを鑑み、本研究では、維持をcPLA2 conditional knock-out マウスでおこない、必要に応じてCre-recombinase (Cre) を発現しているマウスとかけ合わせることで、cPLA2 knock-outマウスを作ることができるシステムを取り入れた計画とした。cPLA2 conditional knock-out マウス作成のためのtargeting vector構築にあたっては、Gateway systemを利用した。ES細胞は5’-loxPと3’-loxPとにはさまれたシーケンスを含むtargeted alleleを持つことになるのでCreを発現している細胞ではloxPで挟まれた部分のDNAは取り除かれる。受精して生まれたtargeted alleleを持つマウス (cPLA2 conditional knock-outマウス)とCreを発現したマウスとをかけ合わせることで、cPLA2 knock-outマウスを作ることができる。すでに以下の作業が終了している。1）cPLA2 conditional knock-out マウス作成のためのtargeting vector構築　2）完成したvectorのPCRおよびSouthernブロット解析　3）受精卵の準備およびキメラマウスの作成
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason targetingベクターの構築に手間取り、遅れ気味であったが、その後ペースを早くすることが可能になったため、次第に計画に追いついてきている。
Strategy for Future Research Activity	25年度はcPLA2 knock-outマウスの作成を完了したい。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	平成24年8月、ES細胞を完成させるため、ベクターの作成を行っていたが、マウスのゲノムDNAのクローニング及びノックアウトマウスと野生型マウスを区別するために必須であるサザンハイブリダイゼーションの条件設定に予想外に時間がかかり、研究に遅延が生じた。 1.理研より送付されるキメラマウスをオリエンタル酵母工業(株)にて飼育し、継承マウスとして確立するために用する費用（6か月間、15ゲージ使用）として、600,000円 2.理研よりCreマウスを購入するための費用　１匹50,000円×10匹＝500,000円 3.成果発表にかかる旅費として、70,000円 4.マウス飼育に用する人件費　800円＠×3時間/日×4日/週×6か月＝230,000円 5.長大・動物実験施設での飼育に必要な経費として、100,000円