2014 Fiscal Year Research-status Report
組換えウイルスを用いたＡＬＳ運動ニューロン培養系およびモデルラットの樹立と解析
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24500428
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
渡部 和彦 公益財団法人東京都医学総合研究所, 運動・感覚システム研究分野, 副参事研究員 (30240477)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 運動ニューロン / TDP-43 / FUS / 筋萎縮性側索硬化症 / 凝集体 / 組換えウイルス / プロテアソーム / オートファジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はこれまで，TDP-43, FUS cDNAや蛋白分解系を阻害するshRNAを発現する組換えアデノウイルスをラット，マウス末梢神経に混合接種すると，ウイルスの軸索内逆行輸送により運動ニューロンに細胞質内凝集体を形成しうることを報告した．しかし組換えアデノウイルスによる外来遺伝子発現は接種後1週間をピークに急速に減衰していく．そこで，より長期間安定した遺伝子導入発現が期待できる組換えアデノ随伴ウイルス9型(AAV9)または組換えレンチウイルス(LxFuGB2)に関して検討した．ヒト正常またはC末断片 (208-414) TDP-43，正常または変異(P525L) FUSをDsRedとともに発現する組換えAAV9およびLxFuGB2，プロテアソーム(PSMC1)，オートファジー(ATG5)に対するshRNAをEGFPとともに発現する組換えAAV9およびLxFuGB2を，８週齢ICRマウスの顔面神経または坐骨神経に注入接種したところ，軸索逆行輸送により注入後2~4週間で顔面神経核，腰髄前角運動ニューロンに限局してTDP-43, FUS, shRNA導入遺伝子の発現を認め，TDP-43またはFUS/DsRedとPSMC1, ATG5 shRNA/EGFP組換えAAV9の共感染により運動ニューロン細胞体に凝集体が形成された．当初は感染運動ニューロンに限局するこれら凝集体が伝播していくか否かを経時的に観察できると考えられた． 一方，培養ラット神経幹細胞由来ニューロンに，ヒト正常またはC末断片TDP-43をDsRedとともに発現する組換えアデノウイルスを共感染させ，プロテアソーム阻害剤MG-132を負荷すると，タイムラプス蛍光撮影で12時間後よりDsRed陽性凝集体が形成されはじめ，細胞質に徐々に充満し，やがて細胞膜の破綻とともに細胞死に至る像が多数観察された．現在，凝集体の細胞間伝播の可視化に関しても検討を行っている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
１．組換えアデノウイルス，組換えレンチウイルス，組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)の作製：①ALS関連遺伝子のクローニング：ヒト正常および変異TDP-43またはC末断片TDP-43，正常および変異FUS, VCP, UBQLN2をDsRed発現ベクターにクローニングした．②shRNA発現ベクターの作製：以下の遺伝子の発現を阻止しうるラットshRNA配列をpGneneClip-hMGFP (Clontech)にクローニングした；PSMC1, TSG101, VPS24, CHMP2B, Atg5, Atg7, TDP-43, FUS, VCP, UBQLN2 ADAR2．③組換えウイルスの作製：上記①②のcDNA/DsRed断片，shRNA/GFP断片を発現する組換えアデノウイルス，レンチウイルス，AAV9を作製，大量培養ののち精製ウイルスを得た．
２．培養運動ニューロンにおける凝集体形成と細胞死の解明：培養ラット胎仔初代腰髄運動ニューロン，またはマウスES細胞から分化させた運動ニューロンに，上記組換えアデノウイルス，レンチウイルス，AAV9を感染させた．また成体ラット神経幹細胞から分化させたニューロン・グリア（アストロサイト，オリゴデンドロサイト）にも感染を試みた．TDP-43, FUS発現ウイルスと各shRNAウイルスの共感染によりニューロン，グリア細胞内凝集体の形成過程を解析した．またタイムラプス蛍光撮影により凝集体形成に伴う細胞死を経時的に観察しえた．
３．成体マウス・ラット運動ニューロンにおける凝集体形成と細胞死の解明：成体マウス・ラットの顔面神経，坐骨神経に上記組換えウイルスを単独または複数の組み合わせにより注入接種し，組換えウイルスの逆行輸送による運動ニューロンにおける導入遺伝子の発現を確認し，細胞質凝集体の形成に成功した．
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| Strategy for Future Research Activity |
１．培養運動ニューロンにおける凝集体形成と細胞死の解明：前年度に引き続き，初代運動ニューロン，ES細胞分化運動ニューロン，iPS細胞分化運動ニューロン，神経幹細胞分化ニューロン・グリア細胞培養系に組換えアデノウイルス，レンチウイルス，AAV9を感染させ，凝集体の形成過程をタイムラプス蛍光撮影により経時的に観察するほか，蛍光抗体法，免疫電顕による解析も行う．
２．成体マウス，ラット運動ニューロンにおける凝集体形成と細胞死の解明：前年度に引き続き解析をすすめるとともに，レーザーマイクロダイセクションによって凍結組織切片から蛍光陽性の凝集体を持つ運動ニューロンを切り出して回収し，RNAを調製，リアルタイムRT-PCRにより凝集体形成と遺伝子発現の関連を解析する．以上により， TDP-43, FUSとプロテオソーム・エンドソーム・オートファジーのどの遺伝子を過剰発現あるいはノックアウトすると凝集体が形成されうるか，細胞死の鍵を握る分子は何か，蛋白分解系，凝集体形成と細胞死にはどのようにリンクがあるのか，グリア細胞の関与は必要か否か，を解明する．
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| Causes of Carryover |
当初予定していた組換えレンチウイルスの作製に時間を要したため，組換えウイルス作製完了に伴う培養細胞実験および動物実験を次年度に行う必要がある．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
培養細胞実験および動物実験に必要な消耗品費（500千円）；実験動物として，3-4ヶ月齢ICRマウス200匹，妊娠雌マウス20匹，3-4ヶ月齢Fischer 344雄ラット30匹の購入に計300千円．器具消耗品費としては培養基材，チューブ，ピペットなどに計200千円を計上．
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[Presentation] Phase numbers and duration of fasciculation potentials (FPs) have negative correlation with muscle strength in ALS patients---A quantitative analysis-.2014
Author(s)
Bokuda K, Shimizu T, Kimura H, Yamazaki T, Sekiguchi T, Kamiyama T, Watabe K, Kawata A, Tanaka K, Nakano I.
Organizer
25th International Symposium on ALS/MND
Place of Presentation
Brussels, Belgium
Year and Date
2014-12-06
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[Presentation] Schwann cell biology and pathology.2014
Author(s)
Watabe K.
Organizer
Brain Conference 2014, the Joint Conference of Congress of Asian Society of Neuropathology, Korean Society for Brain and Neural Science, and Korean Society for Neurodegenerative Diseases.
Place of Presentation
Seoul, Korea.
Year and Date
2014-11-06
Invited
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[Presentation] Myelination in coculture of rodent stem cell-derived neurons and Schwann cell lines.2014
Author(s)
Watabe K, Ishii T, Yanagisawa H, Sango K, Akiyama K, Kawakami E, Endo K, Tsukamoto M, Niimi N, Akutsu H, Misawa H.
Organizer
XVIIIth International Congress of Neuropathology
Place of Presentation
Rio de Janeiro, Brazil
Year and Date
2014-09-17
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[Presentation] Retrograde axonal delivery of TDP-43 and FUS genes using AAV9 and lentivirus vectors to adult mouse motoneurons.2014
Author(s)
Ishii T, Akiyama K, Kawakami E, Yanagisawa H, Sango K, Okado H, Miwa A, Miyake K, Kato S, Kobayashi K, Misawa H, Watabe K.
Organizer
XVIIIth International Congress of Neuropathology
Place of Presentation
Rio de Janeiro, Brazil
Year and Date
2014-09-15
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