2012 Fiscal Year Research-status Report
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24500469
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
増田 章男 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (10343203)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 神経筋接合部 / スプライシング / RNA代謝 |
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| Research Abstract |
本研究は神経筋接合部特異的なRNA代謝機構の同定およびその機能解析を目的とする。
1: Laser microdissection法による、マウス切片より骨格筋-神経筋接合部および通常骨格筋部位-total RNA回収。
2: Gene Chip（exon array）による、スプライシングパターンの網羅的解析
3: 神経筋接合部特異的RNA代謝機構の詳細の解析、その生体における意義の解明
の3段階で研究を施行予定である。
当該年度は、1について検討した。まず、マウス切片の染色条件について検討を行った。バンガロトキシン染色、アセチルコリンエステレース染色について染色能、染色後のRNA分解状況について検討した。後者の染色を4℃10分の条件で行うことにより、微量RNAの分解を防ぎつつ、神経筋接合部特異的な染色を得られることが判明した。次に、この染色下にLaser microdissection法を行い、RNAの回収法について検討したところ、約5000箇所の神経筋接合部に対しRNeasy micro columnを用いると、2-3 ng程度のtotal RNAが回収できることが判明した。GeneChip解析には、50ngのRNAが必要であるため、ovation kitを用いたRNA増幅を行うこととした。実際に増幅を行ったところ、GeneChip解析に十分な量のcDNAが合成された。rt-PCRにより、Ache、Muskなど神経筋接合部特異的な発現を示すmRNAの発現を確認したところ、control領域から得られたcDNAに比べ、神経筋接合部から増幅されたcDNAには、著しい発現が見られ、神経筋接合部RNAの回収成功を確認した。今後、GeneChip解析を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1: Laser microdissection法による、マウス切片より骨格筋-神経筋接合部および通常骨格筋部位-total RNA回収。
2: Gene Chip（exon array）による、スプライシングパターンを網羅的解析
3: 神経筋接合部特異的RNA代謝機構の詳細の解析、その生体における意義の解明
の3段階で研究を施行予定である。
当該年度は、1について検討し、目的を達成した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1: Laser microdissection法による、マウス切片より骨格筋-神経筋接合部および通常骨格筋部位-total RNAを回収。 2: Gene Chip（exon array）により、スプライシングパターンを網羅的に解析 3: 神経筋接合部特異的RNA代謝機構の詳細の解析、その生体における意義の解明
の3段階で研究を施行予定である。
当該年度は、1について検討し、目的を達成した。今後は、２および３について推進していく。２のスプライシングパターン解析については、GeneChip施行予定であり、すでに準備が終了している。これに加え、近年、進展が著しい次世代シークエンサーによるRNA-seq解析も行っていきたい。RNA-seq解析では、annotationされていない未知のスプライシングパターンの検出が可能であり、GeneChip解析との組み合わせにより、さらにRNA代謝の詳細の解明につながるものと、期待される。得られた網羅的dataを用いて、スプライシングのみならず、5'UTR領域、3'UTR領域、さらにはnoncodingRNAなどの変化についても、検討を行っていきたい。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
GeneChip(Exon Array)解析を行うため、試薬類やプラスティック器具類の購入が必要である。
RNA-seq解析を行うため、試薬類やプラスティック器具類の購入が必要である。
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[Journal Article] Mutations in the C-terminal Domain of ColQ in Endplate Acetylcholinesterase Deficiency Compromise ColQ-MuSK Interaction.2013
Author(s)
Nakata T, Ito M, Azuma Y, Otsuka K, Noguchi Y, Komaki H, Okumura A, Shiraishi K, Masuda A, Natsume J, Kojima S, Ohno K.
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Journal Title
Hum Mutat
Volume: Epub ahead of print
Pages: Epub
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Four parameters increase the sensitivity and specificity of the exon array analysis and disclose 25 novel aberrantly spliced exons in myotonic dystrophy.2012
Author(s)
Yamashita Y, Matsuura T, Shinmi J, Amakusa Y, Masuda A, Ito M, Kinoshita M, Furuya H, Abe K, Ibi T, Sahashi K, Ohno K.
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Journal Title
J Hum Genet
Volume: 57
Pages: 368-374
DOI
Peer Reviewed
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