2014 Fiscal Year Research-status Report
細胞増殖のシグナル伝達に関わるＮＡＤＰＨオキシダーゼ１の活性制御と情報伝達機構
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24510299
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
田村 実 愛媛大学, 理工学研究科, 准教授 (00128349)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | superoxide / Nox1 / beta Pix / signal transduction / oxidative stress / apoptosis / nanodevice / Caco-2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1.ヒト大腸癌細胞Caco-2にbetaPix遺伝子を導入し、内在性Nox1によるスーパーオキシド生成が亢進することを見いだした。このことはbetaPixによりNox1の必須因子Racが活性化されたことを示唆するが、Racの活性化とbetaPixへの結合能の検討から実際にこのことが確認された。betaPixは上流からの情報の中継点にあり、この酵素自身の調節も注目されるが、我々はリン酸化がその機構であることを見いだした。興味深いことにリン酸化の位置によってbetaPixは正の方向にも負の方向にも調節されるのであった。またその調節に伴い、betaPixのRac結合能が変化することも見いだした。
2.betaPixの各ドメインの働きを知るために、各種の短縮型betaPixを組み換えタンパク質として調製し、Rac結合活性とGEF活性（GDP-GTP交換活性）を調べた。これにより、Rac結合領域、GEF活性領域を浮き彫りにすることができた。
3.Nox精製の試み Nox1/Nox2が共通にもつサブユニットp22の抗体を用いてNox (今回はNox2)の精製を試みた。好中球の膜を可溶化したものを抗体を結合した磁気ビーズに吸着させた。p22抗原ペプチドによる溶出でp22が得られたが、p22と会合しているはずのNox2は残念ながら回収されなかった。今後可溶化の条件をていねいに検討してp22とNox2の複合体を分離したい。
4.Noxの発生したスーパーオキサイドがどのように細胞に情報伝達するかを見るために、このたび我々が開発したスーパーオキシド発生ナノデバイスを用いて、ヒト培養細胞Caco-2に対する影響を見た。４時間の作用で細胞は明らかにアポトーシスの兆候を示した。すなわち、Caspase-3の活性化およびホスファチジルセリンの細胞外への露出が観察された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
スーパーオキシド生成型酵素 NADPH oxidase1 (Nox1) の活性化について、活性化因子Racの上流の制御因子としてbetaPixをつきとめることができた。さらにその活性がリン酸化の部位により正負両方向に制御されうることを見いだした。
また細胞に対するスーパーオキサイドの影響を調べ、これがシグナルの元になって細胞にアポトーシスを引き起こすことを見いだした。さらにこのシグナルがスーパーオキシドから派生する過酸化水素であることを明らかにした。
これらの知見を確実なものにするための検証実験を重ね、最終的に論文にまとめて、国際誌に３報の英語論文を出版することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.betaPixは、Racを介してNox1活性化だけでなく、それ以外の細胞応答も引き起こす。このスイッチングがどのように行われるのかをリン酸化部位とタンパク質間相互作用の面から追究したい。
2.細胞に対するスーパーオキシドの作用について、アポトーシスのほかに増殖や細胞の変形・運動などにおいてどのような役割があるのか、ナノデバイスを用いスーパーオキシドの濃度を変化させて検討する。また細胞膜タンパク質のカルボニル化や脂質の過酸化などについても検討する。
3.さらに、スーパーオキシドが、シグナル分子である過酸化水素の前駆体としての役割以外に、何か役割をもたないかどうかについても検討したい。
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| Causes of Carryover |
昨年は、建物の耐震工事とそれに伴う実験室の引っ越しがあり、２ヶ月以上にわたって実験が満足にできなかった。このため予算の執行が遅れ、一部の予算を次年度に繰り越すことになった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
細胞培養のための培地、細胞実験に必要なケイ光試薬、また組換タンパク質の精製に必要なアフィニティー樹脂などの購入に充てる。またタンパク質相互作用の検討のためのプルダウンアッセイの標的タンパク質の検出に用いる抗体の購入に充てる。
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