2015 Fiscal Year Annual Research Report
細胞増殖のシグナル伝達に関わるＮＡＤＰＨオキシダーゼ１の活性制御と情報伝達機構
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24510299
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
田村 実 愛媛大学, 理工学研究科, 准教授 (00128349)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | superoxide / Nox1 / betaPix / signal transduction / oxidative stress / apoptosis / nanodevice / Caco-2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1.ヒト大腸癌細胞Caco-2にbetaPix遺伝子を導入すると内在性Nox1によるスーパーオキシド生成が亢進した。Racの活性化の検討とbetaPixへの結合能の検討から、betaPixによりNox1の必須因子Racが活性化されることが判明した。さらにこの酵素自身の調節が、膜受容体への成長因子の結合により誘導されるリン酸化により行われることを見出した。その際、リン酸化の位置によってbetaPixは正にも負にも調節されることが明らかになった。
2.リン酸化による調節機構を知るために、betaPixのC-末端またはN-末端側を短縮した遺伝子を細胞導入し、スーパーオキシド生成に対する影響をみた。またそれぞれのタンパク質を大腸菌で組換えタンパク質として調製し、GEF活性とRac結合能をin vitroで検討した。その結果、GEF活性はN-末端に存在すること、しかしRac結合サイトはN-末端側, C－末端側の双方に存在することを見出した。さらに、N-末端側のリン酸化ではN-末端サイトへのRac結合が、C－末端側のリン酸化ではC－末端サイトへの結合が亢進することを示した。すなわち、betaPixのリン酸化による正逆両方向への活性調節はのRac結合サイトの移動によるものであることが判明した。
3.Noxの発生したスーパーオキシドがどのように細胞に影響するのかを見るために、我々が開発したス－パーオキサイド発生デバイスを用いて、Caco-2に対する外からの活性酸素の影響を見た。４時間の作用で細胞はアポトーシスの様相を示した。すなわち、Caspase-3の活性化およびホスファチジルセリンの細胞外への提示が観察された。そこで細胞内タンパク質の酸化をカルボニル化を指標に検出し、TOF-MAS分析で酸化タンパク質を同定したところ、ミオシン、フィラミンなどの細胞骨格タンパク質、解糖系酵素、タンパク質合成系因子の酸化が認められた。これらのことは活性酸素のもたらす大腸細胞の傷害と炎症性腸疾患との関連から興味が持たれた。
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