2014 Fiscal Year Research-status Report
真核生物におけるチロシンキナーゼ獲得過程の進化的検証
| Project/Area Number |
24510307
|
|---|
| Research Institution | Toho University |
|---|
Principal Investigator |
川田 健文 東邦大学, 理学部, 教授 (30221899)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | チロシンキナーゼ / シグナル伝達 / 転写因子 / SH2ドメイン / 細胞性粘菌 / チロシンキナーゼ様タンパク質 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質のチロシン残基のリン酸化、脱リン酸化とその伝達を司る３つのタンパク質部品が異なる進化段階で順次獲得されたという説がある。細胞性粘菌はチロシンリン酸化シグナル進化の分岐点に位置し、典型的なチロシンキナーゼを有さない。我々はこれ迄にチロシンをリン酸化するチロシンキナーゼ様タンパク質(TKL)を複数同定した。本研究では、原生生物では複数のTKLが複合的に作用してチロシンキナーゼの役割をするという仮説のもと、細胞性粘菌の個々のTKLの機能と夫々の相互作用を調べることで、TKLの作用機作の解明を目指している。
26年度では、積み残した個々のTKLの機能解析とそれ迄に得られた個々の遺伝子破壊株を利用した2重遺伝子破壊株の作製に主眼を置いた。その結果、特にSTATaのリン酸化に関わる可能性が高い2つ遺伝子の2重遺伝子破壊株がもう１種類得られた。予備的な解析から2つの遺伝子は互いをサプレスする複雑な関係であることがわかってきた。この株を用いて残りの１つの遺伝子をdominant negativeにした株も作製した。
また、STATaをリン酸化する最有力TKLのリコンビナントタンパク質を精製し、in vitroでTKLの自己リン酸化特異的にSTATaを直接リン酸化することを示した。現在、他のTKLについても同様の実験を進めている。
今迄多細胞体中のSTATaリン酸化の消失や低下は不鮮明であったが、最有力なTKLについては若干の低下がみられ、メインの調節因子として作用していることが示唆された。しかし、STATaのリン酸化が消失するわけではなく、依然として冗長的に作用しているという昨年までのデータが再現された。このことは、多細胞体の発生過程においては複数のTKLが特異的なチロシンリン酸化に関わっていることを示唆し、チロシンキナーゼ獲得過程について重要な知見を提供している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
作製された候補TKL遺伝子のほとんどの遺伝子破壊株では、cAMPによる誘導実験でSTATa リン酸化レベルの低下が見られた。26年度は、新規に2重TKL遺伝子破壊株を1つ作製できた。キナーゼドメインのATP結合部位に変異を導入したkinase dead TKL過剰発現株を利用した3重遺伝子破壊株も1つ作製できた。2重遺伝子破壊株を用い、cAMPによる誘導実験でSTATaのリン酸化レベルの変動を調べたところ、単独の遺伝子破壊株と比較してSTATaのリン酸化レベルがむしろ上昇し、複数のTKL間で複雑な遺伝的相互作用があることが示唆された。別のTKLはチロシンキナーゼ活性を有せず、セリンキナーゼ活性を有し、STATaを直接リン酸化しないと考えられるが、遺伝子破壊株を用いたcAMP誘導実験ではSTATaのリン酸化レベルが低下し、間接的な制御が示唆された。また、別のTKLの遺伝子破壊株ではSTATaのリン酸化レベルが上昇し、負の制御に関連していることが示唆された。
25年度に見られたリコンビナントHis-STATaがリン酸化されていたという問題はほとんどリン酸化されていないものを得ることができた。これを基質として用い、1つのリコンビナントTKLと混ぜて反応させたところ、STATaが直接リン酸化された。このリン酸化はkinase dead TKLや変異型STATaでは検出できなかったことから、自己リン酸化されたTKLのリン酸化チロシンがSH2ドメインを介して結合し、特異的にSTATaをリン酸化したことが示された。このように、26年度はTKLの機能や複数のTKL間の相互作用を示唆する結果が多く得られ、進展があった。これらの成果を4つに分けて学会発表を行った。
これらの相互作用の解析に多くの時間を費やしてしまったために、今まで未解析の23個のTKL遺伝子について、キナーゼドメイン過剰発現株を作製する計画であったが、これについては26年度も手を付けられなかった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今までに有力な候補TKL遺伝子の単一遺伝子破壊株は全て、2重遺伝子破壊株を2つ、及びdominant negativeを利用した3重遺伝子破壊株を１つ得た。今後は引き続き未作製の組み合わせの2重遺伝子破壊株、3重遺伝子破壊株、及び4重遺伝子破壊株の作製を行なう。そのために、Cre-loxPシステムを利用することを考えていたが、遺伝子によっては上手くいかないために、複数のdominant negativeコンストラクトを形質転換することで作製を試みる。2重遺伝子破壊株はハイグロマイシンB耐性カセット(hygR)を用いての作製できたので、今後は他の薬剤が利用できないか検討する。得られた株についてcAMPによる誘導実験と通常発生におけるSTATaリン酸化レベルの変動を野生型や親株と比較し、遺伝学的な相互作用を検討する。また、各種変異株の多細胞期におけるSTATaの局在と発生の表現型についても詳細に調べる。
生化学的な性質を調べるため、26年度までにほとんどのMycあるいはGFP融合TKLタンパク質の発現株を作製した。27年度は、これらを用いた共免疫沈降法によってTKLとSTATaの結合を確かめる。また、HisタグやHAタグなど別のタグに入れ替えることで、TKLどうしの結合が見られるかも検討する。また、今まで２つのTKLについては過剰発現が致死的になるか、C末端側のタグが除去される可能性があるため、TKLのN末側のシグナル配列の下流にタグを導入したタンパク質を発現する株を作製する。また、in vitroでの解析が行われていない2つのTKLについて大腸菌中で発現して精製し、自己リン酸化能を調べてSTATaとのpull downアッセイ、及びin vitroでのSTATaリン酸可能の検証を行う。また、免疫沈降で精製したMyc融合TKLタンパク質とHis-STATaを混ぜてin vitro実験にてリン酸化能を検証する。コントロールとしてkinase deadのTKLや変異型のSTATaも用いる。
|
| Causes of Carryover |
誤差はわずかであるため、ほぼ研究計画通りに使用している。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
27年度の使用計画も申請当初と比較して大きな変更は無い。27年度もほとんど消耗品に使用する。培養関連のプラスチック器具や培地用の試薬・薬品が主となり、多重遺伝子破壊株スクリーニングのための合成DNAオリゴ作製代、PCR用の酵素、プラスミド精製キットなどにも支出する。この他、タンパク質精製用のアフィニティー担体、免疫沈降やプルダウンのための各種タグの対する市販の抗体やマグネティックビーズを購入するほか、ウエンタンブロット用の試薬やプレキャスト・ゲルにも多くを支出する。
|
-
[Journal Article] Two Dictyostelium tyrosine kinase-like kinases function in parallel, stress-induced STAT activation pathways.2014
Author(s)
Araki, T., Vu, L.H. Sasaki, N., Kawata, T., Eichinger, L. and Williams, J.G.
-
Journal Title
Molecular Biology of the Cell
Volume: 25
Pages: 3222-3233
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
-
-
-
-
-
