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2012 Fiscal Year Research-status Report

糖鎖シルセスキオキサン型プローブを用いる抗糖鎖抗体スクリーニングシステムの開発

Research Project

Project/Area Number 24510318
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Research InstitutionThe Noguchi Institute

Principal Investigator

水野 真盛  公益財団法人野口研究所, 研究部, 研究員 (40271506)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 藤田 雅也  公益財団法人野口研究所, 研究部, 研究員 (20321672)
川上 宏子  公益財団法人野口研究所, 研究部, 研究員 (40320254)
Project Period (FY) 2012-04-01 – 2015-03-31
Keywordsバイオプローブ / 糖鎖 / フルオラス / 抗糖鎖抗体 / ファージディスプレイ
Research Abstract

本研究の目的は、糖鎖シルセスキオキサン型プローブを用いるハイスループットな抗糖鎖抗体スクリーニングシステムの構築である。本プローブは抗原部位の糖鎖と、クラスター化のコア部位となるシルセスキオキサン(以下POSS)、固定化部位のフルオラス基の3つの部位から成る有機・無機ハイブリッド型プローブである。特に抗原部位の糖鎖以外はバイオイナートなシルセスキオキサンとフルオラス基であることから抗原性を有さず、また非特異的な吸着が抑制できる。さらにプローブ中で糖鎖をクラスター化するため十分な強度の結合定数を有するようになるため、ファージディスプレイ法と組み合わせることで選択性の高い抗糖鎖抗体の迅速スクリーニングが可能となる。
24年度は①:フルオラスタグ含有POSSコアブロックの合成と、②:①で合成したフルオラスタグ含有POSSブロックに導入する糖鎖部位の合成、を行った。
まず①についてはPOSSブロックの合成に付いて種々検討を行った結果、当初計画の構造である7つのアルキン基を有するPOSSブロックの合成は非常に困難であることが明らかとなった。そこで糖鎖導入部位用官能基、及びフルオラスタグ導入部位用官能基について様々な官能基を用いてPOSSブロックの合成の検討を行った。その結果、糖鎖部位を導入する官能基としてビニル基を、フルオラスタグ部位を導入する官能基としてアジド基を有するPOSSブロックの合成に成功した。
次に②については、POSSブロックに対して糖鎖部位をチオールのラジカル付加により導入することを念頭に、末端にチオール基を、かつスペーサー部位にPEG鎖を有する糖鎖誘導体の合成を行った。糖鎖としては実施計画通りラクトースを選択した。合成法について種々検討を行った結果、末端にチオール基を、かつスペーサー部位にPEG鎖を有するラクトース誘導体の合成に成功した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究の目的は、糖鎖シルセスキオキサン型プローブを用いるハイスループットな抗糖鎖抗体スクリーニングシステムの構築である。本プローブは抗原部位の糖鎖と、クラスター化のコア部位となるシルセスキオキサン(以下POSS)、固定化部位のフルオラス基の3つの部位から成る有機・無機ハイブリッド型プローブである。特に抗原部位の糖鎖以外はバイオイナートなシルセスキオキサンとフルオラス基であることから抗原性を有さず、また非特異的な吸着が抑制できる。さらにプローブ中で糖鎖をクラスター化するため十分な強度の結合定数を有するようになるため、ファージディスプレイ法と組み合わせることで選択性の高い抗糖鎖抗体の迅速スクリーニングが可能となる。
24年度は①:フルオラスタグ含有POSSコアブロックの合成と、②:①で合成したフルオラスタグ含有POSSブロックに導入する糖鎖部位の合成、を行った。
まず①についてはPOSSブロックの合成に付いて種々検討を行った結果、当初計画の構造である7つのアルキン基を有するPOSSブロックの合成は非常に困難であることが明らかとなった。そこで糖鎖導入部位用官能基、及びフルオラスタグ導入部位用官能基について様々な官能基を用いてのPOSSブロックの合成の検討を行った。その結果、糖鎖部位を導入する官能基としてビニル基を、フルオラスタグ部位を導入する官能基としてアジド基を有するPOSSブロックの合成に成功した。
次に②については、POSSブロックに対して糖鎖部位をチオールのラジカル付加により導入することを念頭に、末端にチオール基を、かつスペーサー部位にPEG鎖を有する糖鎖誘導体の合成を行った。糖鎖としては実施計画通りラクトースを選択した。合成法について種々検討を行った結果、末端にチオール基を、かつスペーサー部位にPEG鎖を有するラクトース誘導体の合成に成功した。

Strategy for Future Research Activity

25年度は①フルオラスタグ含有糖鎖POSSプローブ、及び②フルオラス相互作用による糖鎖POSSプローブの固定化、更に③GM3型糖鎖部位の合成を行う。
①については、24年度に合成したシルセスキオキサンコアブロックに対してフルオラス部位をHuisgen 反応により、糖鎖部位をラジカル付加によりそれぞれPOSSコアブッロックへ導入し、フルオラスタグ含有糖鎖POSSプローブの合成を行う。特に糖鎖部位の導入については24年度に合成したラクトース誘導体を用い、付加反応の条件について検討し、糖鎖導入の最適条件を決定する。②についてはPTFE製プレートに①で合成した糖鎖POSSプローブをフルオラス相互作用で固定化する。本研究では固定化の溶媒、濃度、洗浄溶媒の種類について検討を行い、プローブの固定化量を測定する。固定化量の測定には酵素標識あるいは蛍光標識レクチンなどを用いる。もし、パーフルオロオクチル基では固定化が不十分、あるいは洗浄工程での剥離などの結果が得られた場合はパーフルオロオクチル基を複数本有する糖鎖POSSプローブを合成し、固定化の検討を行う。③については24年度合成したラクトース誘導体の合成を参考に行う。
26年度は④プローブ構造の最適化、及び⑤ファージディスプレイ法による抗糖鎖抗体スクリーニングシステムの構築を行う。⑤については平成25年度②の結果を基に、クラスター効果を保ちつつ、抗体の結合を妨げない適度な長さのスペーサーの検討を行い、プローブ構造の最適化を行う。⑥については、⑤で得られた糖鎖POSSプローブを固定化したデバイスを用い、M13ファージを用いてファージディスプレイ法により抗糖鎖抗体のスクリーニングを行う。もしpositiveなファージが得られにくい場合はスペーサー部位にアジュバント様スペーサーを有するプローブを合成する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

25年度は設備備品として低温恒温水槽の購入を計画している。25年度の研究計画であるGM3糖鎖合成においてシアル酸のグリコシル化反応を行う。この反応は-30℃以下の低温化で行う必要がある。ドライアイス―有機溶媒による冷却では温度維持に安定性がなくグリコシル化反応には不向きのため、安定した温度管理ができる低温恒温水槽の使用が必要である。そこで、本装置に設備備品代として63万円の支出を予定している。またフルオラス科学、及び糖鎖工学に関する内外の学会に参加し研究成果の発表や研究者との意見交換を行うため、旅費として40万円の支出を予定している。それ以外は研究遂行のために試薬類や器具類、論文投稿等の消耗品費としての使用を計画している。

  • Research Products

    (7 results)

All 2013 2012

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (4 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] Overproduction of anti-Tn antibody MLS128 single-chain Fv fragment in Escherichia coli cytoplasm using a novel pCold-PDI vector2012

    • Author(s)
      Ganesh P. Subedi, Tadashi Satoh, Shinya Hanashima, Akemi Ikeda, Hiroshi Nakada, Reiko Sato, Mamoru Mizuno, Noriyuki Yuasa, Yoko Fujita-Yamaguchi, Yoshiki Yamaguchi
    • Journal Title

      Protein Expression and Purification

      Volume: 82 Pages: 197-204

    • DOI

      10.1016/j.pep.2011.12.010

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A dimethoxytriazine type glycosyl donor enables a facile chemo-enzymatic route toward α-linked N-acetylglucosaminyl-galactose disaccharide unit from gastric mucin2012

    • Author(s)
      Masato Noguchi, Miwa Nakamura, Ayaka Ohno, Tomonari Tanaka, Atsushi Kobayashi, Masaki Ishihara, Masaya Fujita, Akiko Tsuchida, Mamoru Mizuno and Shin-ichiro Shoda
    • Journal Title

      ChemComm

      Volume: 48 Pages: 5560-5562

    • DOI

      10.1039/c2cc30946g

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] フルオラスone-potグリコシル化法の開発2012

    • Author(s)
      後藤 浩太朗、弘瀬 友理子、水野真盛
    • Organizer
      フルオラス科学研究会第5回シンポジウム
    • Place of Presentation
      仙台
    • Year and Date
      20121129-20121129
  • [Presentation] 鶏卵由来シアリル糖ペプチドの糖鎖―タンパク質間相互作用解析への利用2012

    • Author(s)
      大隅賢二、近藤純平、藤田雅也、菅原州一、水野真盛
    • Organizer
      第31回日本糖質学会年会
    • Place of Presentation
      鹿児島市
    • Year and Date
      20120917-20120920
  • [Presentation] CARBOHYDRATE SYNTHESIS USING FLUOROUS CHEMISTRY2012

    • Author(s)
      Mizuno, M.; Koichi, K.; Kasuya, M. C. Z.; Hatanaka, K.
    • Organizer
      26th International Carbohydrate Symposium
    • Place of Presentation
      Madrid (Spain)
    • Year and Date
      20120722-20120726
  • [Presentation] SYNTHESIS OF HYBRID GLYCOPEPTIDE2012

    • Author(s)
      Mizuno, M.; Goto, K.; Hiroko, K.; Tojino, M.
    • Organizer
      26th International Carbohydrate Symposium
    • Place of Presentation
      Madrid (Spain)
    • Year and Date
      20120722-20120726
  • [Book] 新しい溶媒を用いた有機合成2013

    • Author(s)
      水野真盛
    • Total Pages
      350
    • Publisher
      S&T出版株式会社

URL: 

Published: 2014-07-24  

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