2014 Fiscal Year Annual Research Report
ヘム生合成経路におけるテトラピロールの構築および環状化のメカニズム
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24550201
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
佐藤 秀明 久留米大学, 医学部, 准教授 (60271996)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
野口 正人 帝京大学, 福岡医療技術学部, 教授 (10124611)
東元 祐一郎 久留米大学, 医学部, 教授 (40352124)
原田 二朗 久留米大学, 医学部, 講師 (10373094)
塚口 舞(古澤舞) 久留米大学, 医学部, 助教 (40624094)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ヘム生合成 / 結晶構造解析 / 酵素反応速度論 / 酵素-阻害剤複合体 / テトラピロール / ポルフィリン生合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
動物におけるヘム生合成経路の第3番目の酵素であるヒドロキシメチルビランシンターゼ(HMBS)は，ジピロメタン補因子をもち，4分子のポルホビリノーゲン(PBG)を順次縮合して鎖状テトラピロールであるヒドロキシメチルビランを合成する。本研究では，HMBSにおけるこの縮合過程について, 酵素化学的および構造生物学的な手法による解明を目指した。
まず，ヒトHMBSを大腸菌で大量発現させ，多段階のカラムクロマトグラフィーで精製し，さらにmono Qカラムで分離して複数のピークを分取した。質量分析により，各ピーク画分はホロ型および基質が1～3個結合したES1～ES3型HMBSに対応することが確認できた。
PBGのピロール環上にヨウ素を導入した2-ヨードポルホビリノーゲン(2-I-PBG)を用いて，ホロ型HMBSの反応速度論解析をしたところ，2-I-PBGが非競合阻害の様式で反応を阻害し，阻害定数Kiは5 μMであった。
また，ホロ型HMBSを20 ℃で結晶化し，大型放射光施設SPring-8のビームラインBL44XU等を用いて構造解析をしたところ，既報でディスオーダーしていた領域の主鎖の構造を2.2 A分解能で決定できた。還元剤のジチオトレイトールを沈殿剤に添加して補因子の酸化を抑えると，結晶化途中での結晶の着色を防止でき，良好な回折像が得られた。
さらに，HMBSの単結晶への2-I-PBGのソーキングによって酵素-阻害剤複合体の結晶を調製し，2.4 A分解能までのX線回折データを収集した。構造解析の結果，2-I-PBGがジピロメタン補因子の遠位側ピロール環の近傍に結合することが明らかとなった。この結果は，基質類似体の2-I-PBGがHMBSの補因子周辺に結合し，活性部位において少なくとも補因子と1つ目の基質PBGとの間での縮合反応を妨げうることを示唆している。
今後，PBGが複数連結したES2～ES4型に対応するHMBS-基質(類似体)複合体の立体構造を解明して，HMBSに対するPBGの結合機構についてさらに検討する予定である。
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[Journal Article] DNA Aptamer Raised Against Advanced Glycation End Products (AGEs) Improves Glycemic Control and Decreases Adipocyte Size in Fructose-Fed Rats by Suppressing AGE-RAGE Axis2015
Author(s)
Ojima, A., Matsui, T., Nakamura, N., Higashimoto, Y., Ueda, S., Fukami, K., Okuda, S., Yamagishi, S.I.
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Journal Title
Hormone and Metabolic Research
Volume: 47(4)
Pages: 253-258
DOI
Peer Reviewed
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