非天然型リジン誘導体をプローブとしたケミカルバイオロジー

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24550203
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 柳沢 達男 独立行政法人理化学研究所, 横山構造生物学研究室, 研究員 (10450420)
• Keywords: 非天然型アミノ酸 / アミノアシルtRNA合成酵素 / tRNA / タンパク質 / ケミカルバイオロジー / バイオテクノロジー / 翻訳 / 翻訳後修飾

Research Abstract

有用な官能基を有する非天然型アミノ酸を部位特異的にタンパク質に導入する方法は生命科学研究において重要な基盤技術となってきている。メタン古細菌由来のピロリジルtRNA合成酵素(PylRS)/tRNAPylペアは大腸菌や酵母、哺乳類細胞、線虫、ショウジョウバエなど多くの生物の宿主由来アミノアシルtRNA合成酵素(aaRS)、tRNAと交差反応しない理想的な非天然型アミノ酸導入システムである。代表者らはPylRSの結晶構造を解明すると共に様々なリジン誘導体をタンパク質に導入できる特異なaaRS/tRNAの組み合わせであることを見いだした。現在では世界各国の研究室で改良が進められタンパク質の翻訳後修飾、蛍光ラベル化、局在検出、相互作用検出、抗体医薬などタンパク質が関わる研究に広く利用される系へと進化を遂げている。本研究課題では理研SSBC（現CLST）拡張遺伝暗号システムチームで作製された翻訳終結因子RF1欠損大腸菌株を用いてアセチルリジン、メチルリジン誘導体、アジド基、アルキン含有リジン誘導体などをタンパク質中の一カ所および複数カ所に導入することを試み、幾つかの非天然型リジン誘導体については既に成功している。現在非天然型リジン誘導体のタンパク質への導入効率を上げると共に、導入したリジン誘導体をプローブとした翻訳後修飾、タンパク質間相互作用、X線結晶構造解析等のケミカルバイオロジー研究や医薬産業分野等への展開を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

幾つかの非天然型リジン誘導体についてはタンパク質内の自由な位置に複数導入することに成功しており、その技術を用いて更なる応用研究へと展開を進めている。

Strategy for Future Research Activity

PylRS-tRNAPylは様々な官能基をもつアミノ酸誘導体をタンパク質に導入することができ、かつ多くの生物のaaRS-tRNAとorthogonal（直交性）という優位性をもつが、歴史が古く系が最適化されているチロシルtRNA合成酵素(TyrRS)-tRNATyrと比較してまだ発展途上の非天然型アミノ酸導入システムである。特に複数導入の場合には導入効率、収量の点で問題となることが多い。よりPylRSに最適化された構造をもつ新規非天然型リジン誘導体の設計および合成、新たな非天然型アミノ酸導入用大腸菌株、発現効率の高いプラスミドやアミノアシル化活性の高いPylRS変異体の作製等、まだまだ工夫が必要である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

高額な非天然型アミノ酸を購入するために、平成25年度分の残りを平成26年度に回しそのための費用に当てることにした。
非天然型アミノ酸の購入に使用する予定である。

Research Products

• [Presentation] In vivo and in vitro site-specific incorporation/installation of non-canonical lysine derivatives into proteins by using pyrrolysyl-tRNA synthetase-tRNAPyl pair and its application for epigenetic studies (2014)
  • Author(s): ○Tatsuo Yanagisawa, Mihoko Takahashi, Shin Sato, Takahito Mukai, Masatoshi Wakamori, Mikako Shirouzu, Takashi Umehara, Kensaku Sakamoto, and Shigeyuki Yokoyama
  • Organizer: RIKEN EPIGENETICS in Yokohama
  • Place of Presentation: 横浜、理研横浜キャンパス
  • Year and Date: 20140217-20140217
• [Presentation] Synthesis of histone with multiple site-specific monomethylation for reconstitution of epigenetic nucleosome (2013)
  • Author(s): ○Mihoko Takahashi, Tatsuo Yanagisawa, Shin Sato, Masatoshi Wakamori, Takahito Mukai, Mikako Shirouzu, Kensaku Sakamoto1, Shigeyuki Yokoyama, Takashi Umehara
  • Organizer: The 65th Fujihara Seminar; International Symposium on Synthetic Biology of Unnatural Base Pairs and Amino Acids
  • Place of Presentation: 苫小牧、グランドホテルニュー王子
  • Year and Date: 20131001-20131001
• [Presentation] Crystallographic studies on specific aminoacylation of tRNA and genetic code expansion (2013)
  • Author(s): Naganuma M, Sasaki HM, Mukai T, Yanagisawa T, Ohtake K, Wakamori M, Hikida Y, Higashijima K, Shibata R, Nishimoto M, Bessho Y, Chong YE, Guo M, Yang XL, Shimmel P, Fukunaga R, Harada Y, Kimoto M, Adachi J, Hino N, Sato A, Hayashi A, Terada T, Umehara T, Ito T, Sekine S, Hirao I, Shirouzu M, Sakamoto K, ○Yokoyama S.
  • Organizer: 7th International Conference on Structural Genomics 2013
  • Place of Presentation: 札幌、京王プラザホテル
  • Year and Date: 20130731-20130731