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2013 Fiscal Year Research-status Report

Cre-loxPシステムを用いた糸状菌二次代謝遺伝子利用技術の開発

Research Project

Project/Area Number 24560960
Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

木下 浩  大阪大学, 生物工学国際交流センター, 助教 (20294035)

Keywords二次代謝物質 / Aspergillus
Research Abstract

平成24年度に形質転換のマーカー系として構築したアルギニン生合成遺伝子argBの変異株が不安定であることが判明したために、今年度新たに、宿主となるAspergillusではウラシル合成系遺伝子pyrGの破壊株を、Lecanicilliumにおいてはトリプトファン合成遺伝子trp1をの変異株およびマーカー遺伝子の取得を行った。さらに作成したtrp1変異株に、trp1遺伝子を導入することで、trp1遺伝子がマーカー遺伝子としてLecanicilliumで機能しうることを確認した。
利用可能となったtrp1遺伝子を用いてloxP導入用ベクターの再構築を行い、さらに、pCC1FOSへウリジン生合成遺伝子pyrGを組み込んだクラスタークローニングベクターを再構築した。続いて上記で構築したloxP導入用ベクターと、クローニング用ベクターを標的生合成遺伝子クラスターの両端への導入を試みた。得られた形質転換株についてPCRおよびサザン解析により遺伝子型解析を行ったところ、想定した位置に両ベクターが挿入された目的形質転換株が得られたことが確認できた。
次にCre酵素によるクローニングベクターの切り出し条件について検討を行った。まず、試薬に付属のコントロールを用いて、切り出しに至適な条件を決定した。続いて上記で得られたLecanicillium形質転換体からゲノムを抽出し、Cre酵素の反応を行った。現在、その至適条件を検討中である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

クローニングに必要なloxP配列を標的クラスター両端に導入することに、成功し、クローニング実験を行う段階まで進んでいるから。

Strategy for Future Research Activity

クラスターをクローニング後、宿主であるAspergillusに導入する。得られた形質転換体を培養し、新たに生産される化合物を探索する。見出された化合物について、精製を行い、NMR,MS等により構造決定を行う。さらに得られた化合物が新規構造を有する場合は様々な生物活性を測定する。

  • Research Products

    (1 results)

All 2014

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results)

  • [Journal Article] Efficient and versatile transformation systems in entomopathogenic fungus Lecanicillium species2014

    • Author(s)
      Kei-ichi Ishidoh, Hiroshi Kinoshita, Fumio Ihara, Takuya Nihira
    • Journal Title

      Curr Genet

      Volume: 60 Pages: 99-108

    • DOI

      10.1007/s00294-013-0399-5

    • Peer Reviewed

URL: 

Published: 2015-05-28  

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