2014 Fiscal Year Annual Research Report
高基質特異性Ｌーアミノ酸オキシダーゼの特性解析と産業応用への基盤構築
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24560962
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
稲垣 賢二 岡山大学, その他の研究科, 教授 (80184711)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
今田 勝巳 大阪大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (40346143)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | L-アミノ酸オキシダーゼ / L-リシン α-オキシダーゼ / 異種発現系の構築 / X線結晶構造解析 / L-グルタミン酸オキシダーゼ / 基質認識機構 / 基質特異性の改変 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
L-グルタミン酸オキシダーゼについて，新たな基質特異性変換酵素の作成に成功した。R305H変異LGOXは，L-Gluに全く反応せず，20種の天然アミノ酸のうち，L-Tyrに対して最も高い活性を示した。 精製酵素のL-Tyrに対するKm値は3.0 mMであり，LGOXとほぼ同じ耐熱性，pH安定性を示した。 R305H変異LGOXを珪藻土に固定し，酵素センサーとしての実用性をH2O2電極により確認したところ，LGOXやHisOX, ArgOX同様に，利用可能であった。L-リシンα-オキシダーゼについては，大腸菌と放線菌両宿主で発現系の構築に成功した。 加えて，前駆体で発現させたLysOXをプロテアーゼ処理したところ，活性が約12 倍，比活性が約17 倍上昇するという結果を得ることができた。 組換え酵素を用いた性質検討の結果，L-Lysに対する高い基質特異性が確認できた。L-Lys以外ではL-Orn・L-Arg等に対してわずかに反応を示した。また，約1.7オングストロームの分解能を持つ基質複合体の結晶を得ることができ，LysOXのX線結晶構造解析に世界で始めて成功した。これにより基質認識に関与する残基としてD212，D315，A440が，高基質特異性の要因としてW371残基が推定された。
FADを補酵素として保有しないL-リシンε-オキシダーゼについても，X線結晶構造解析により立体構造を解明した。補因子として, Trp581とCys516が結合することでシステイントリプトフィルキノン(CTQ)を形成していることが判明し, CTQを補酵素として用いるLAOの存在を初めて明らかとした。 L-リシンとの共結晶から活性中心構造を明らかになり, L-リシンのε-アミノ基はTrp581とシッフ塩基を形成し, L-リシンのα-カルボキシル基はLys530と塩橋を, Gln519と水素結合を形成し, さらにL-リシンのα-アミノ基はGln519と水素結合を形成していることが判明した。このことより, L-リシン ε-オキシダーゼがL-リシンに対して高い基質特異性を有する構造的要因が明らかとなった。
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[Presentation] Pseudomonas putida由来メチオニンγ-リアーゼの結晶構造解析2014
Author(s)
湯之戸俊介, 安田江里, 古谷和大, 福本充樹, 工藤大蔵, 志波智生, 佐藤 暖, 田村 隆, 原田繁春, 稲垣賢二湯之戸俊介, 安田江里, 古谷和大, 福本充樹, 工藤大蔵, 志波智生, 佐藤 暖, 田村 隆, 原田繁春, 稲垣賢二
Organizer
第87回日本生化学会大会
Place of Presentation
京都・国立京都国際会館
Year and Date
2014-10-15 – 2014-10-18
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[Presentation] L-リシン酸化酵素の基質複合体構造2014
Author(s)
近藤裕輝, 杉山 成, 川口辰也, 天野万里, 新屋敷健悟, 日下部均, 田村 隆, 稲垣賢二, 今田勝巳
Organizer
第87回日本生化学会大会
Place of Presentation
京都・国立京都国際会館
Year and Date
2014-10-15 – 2014-10-18
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[Presentation] Engineering of substrate specifity of L-glutamate oxidase from Streptomyces sp.: directed mutagenesis of Arg305 residue2014
Author(s)
Inagaki, K., Fujino, S., Sano, T., Imada, K., Tamura, T., Kusakabe, H.
Organizer
The Fourth International Conference on Cofactors (ICC-04)
Place of Presentation
University of Parma, Parma, Italy
Year and Date
2014-08-25 – 2014-08-28
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[Presentation] Molecular Evolution of Gas Cavity in [NiFeSe]-Hydrogenases Resurrected in silico by Ancestral Sequence Estimation and 3D Modeling by Molecular Dynamics Simulation2014
Author(s)
Tamura, T., Hirano, T., Sato, F., Inagaki, K., Tsunekawa, N.
Organizer
The Fourth International Conference on Cofactors (ICC-04)
Place of Presentation
University of Parma, Parma, Italy
Year and Date
2014-08-25 – 2014-08-28
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[Presentation] A novel structure of a cysteine tryptophylquinone-dependent oxidase, L-lysine-ε-oxidase from Marinomonas mediterranea2014
Author(s)
Okazaki, S., Nakano, S., Matsui, D., Akaji, S., Inagaki, K., Asano, S.
Organizer
The Fourth International Conference on Cofactors (ICC-04)
Place of Presentation
University of Parma, Parma, Italy
Year and Date
2014-08-25 – 2014-08-28
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[Presentation] Gene cloning, recombinant expression, and purification of L-methionine decarboxylase from Streptomyces sp.5902014
Author(s)
Hayashi, M., Okada, A., Tamura, T., Inagaki, K.
Organizer
The Fourth International Conference on Cofactors (ICC-04)
Place of Presentation
University of Parma, Parma, Italy
Year and Date
2014-08-25 – 2014-08-28
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[Presentation] Functional and structural analysis of Peseudomonas putida L-methionine γ-lyase and its C116H Mutant2014
Author(s)
Yasuda, E., Fukumoto, M., Furutani, K., Yunoto, S., Tamura, T., Shiba, T., Sato, D., Harada, S., Inagaki, K.
Organizer
The Fourth International Conference on Cofactors (ICC-04)
Place of Presentation
University of Parma, Parma, Italy
Year and Date
2014-08-25 – 2014-08-28
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[Presentation] Recombinant expression, and molecular characterization of L-lysine alpha-oxidase from Trichoderma viride2014
Author(s)
Kenji Inagaki, Marie Amano, Haruka Mizuguchi, Kengo Shinyashiki, Yuki Saitoh, Yoshiteru Hashimoto, Michiko Kobayashi, Hiroki Kondo, Tadahisa Sano, Katsumi Imada, Takashi Tamura, Hitoshi Kusakabe
Organizer
18th INTERNATIONAL SYMPOSIUM FLAVINS AND FLAVOPROTEINS
Place of Presentation
Mahidol University, Phetchaburi, Thailand
Year and Date
2014-07-27 – 2014-08-01
Invited
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