2014 Fiscal Year Research-status Report
ヒストン修飾酵素複合体による植物ゲノム基盤の構築と制御
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24570065
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
金 鍾明 独立行政法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 研究員 (90415141)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | エピジェネティクス / ヒストン / 植物ゲノム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
シロイヌナズナのヒストン脱アセチル化酵素HDA6は、ゲノムの高次構造やゲノム基盤構築、および遺伝子の発現調節に広範囲に機能すると考えられている。
本実験では、シロイヌナズナヒストン脱アセチル化酵素HDA6の複合体構成因子の同定と、この複合体が機能するゲノム上の結合領域を同定するために、よりアフィニティーの高い抗HDA6モノクローナル抗体を幾つか作成した。そのうち幾つかは、ウェスタンブロット法により高感度のシグナルが検出できることが分かったが、ChIP（クロマチン免疫沈降）法に使用できるほどの感度を呈するものではないことが明らかとなった。一方で、これまでにChIP実験で実績のある抗GFP抗体を用い、複合体の検索同定を行うため、GFPタグを融合したHDA6の遺伝子導入株を作成し、ホモ系統単離に成功した。
これら複合体のゲノム上での機能領域を同定するため、野生型株及びhda6変異株を用いて、活性化および抑制化のマーカーとなるヒストン修飾について、ChIP-seq法によりゲノムワイドな変動領域を同定した。これにより、HDA6がターゲットとする特異的なトランスポゾン領域でのヒストン修飾変動が明らかとなった。また、分子進化学的な解析の結果から、HDA6がターゲットとするトランスポゾンの中でも、hda6変異株では特に比較的若いCOPIAタイプのレトロトランスポゾンの再活性化が顕著であり、HDA6複合体による抑制ターゲットとなっていることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに作成、所得していたペプチドを抗原としたモノクローナル抗体の感度が、本来の目的とするChIP法に使用できるほどの感度ではないことが明らかになったことから、複合体の精製に用いる抗体の再作成を進めることとなった。現在、タンパク質全長を抗原とした新規モノクローナル抗体の作成を進めている。しかしながら、これに代替するGFPタグを融合したHDA6の遺伝子導入株の確立に成功したことから、これを合わせて用い、同様の実験を進めることが可能となっている。このことから、実験計画における設定目標達成に対して、それほど大きな問題は生じていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
HDA6―GFPタンパク質形質転換株、および新規モノクローナル抗体を材料として、プルダウンアッセイを行い、HDA6の複合体構成因子の同定を試みる。また、これまでに得られているゲノムワイドなヒストン修飾状態の解析を進め、HDA6複合体が機能する領域上の共通DNA配列およびターゲット領域の高次構造上の特徴について、インフォマティックな解析等を進めていく。
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| Causes of Carryover |
これまでに作成、所得していたペプチドを抗原としたモノクローナル抗体の感度が、本来の目的とするChIP法に使用できるほどの感度ではないことが明らかになったことから、複合体の精製に用いるタンパク質全長を抗原とした新規モノクローナル抗体の作成を新たに進める必要性が出たため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
HDA6―GFPタンパク質形質転換株および新規モノクローナル抗体を用いた、プルダウンアッセイによりHDA6の複合体構成因子の同定を行う。また、得られた複合体の生化学的解析および、GFP-HDA6株を用いたゲノムワイドなHDA6結合領域の確認をChIP-seq法により行う。
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