2013 Fiscal Year Research-status Report
新規体内時計と環境因子によるクサフグの半月周性産卵リズムの形成機構
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24570069
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
安東 宏徳 新潟大学, 自然科学系, 准教授 (60221743)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
黒川 大輔 東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (40342779)
服部 淳彦 東京医科歯科大学, 教養部, 教授 (70183910)
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| Keywords | 脳・神経 / 生殖リズム / 松果体 / メラトニン / 体内時計 / 時計遺伝子 / 月周リズム / クリプトクローム |
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| Research Abstract |
クサフグにおける半月周性産卵リズムの形成機構を解明するため、松果体に存在すると考えられる15時間周期の新しい体内リズムの発振機構について解析を行う。平成25年度の研究で得られた結果は、次の1）と2）である。
1）脊椎動物において概日時計遺伝子の一つであるクリプトクローム（Cry）は、サンゴやアイゴなどの月周産卵動物において、遺伝子発現量が月周変動し、月齢を測る分子機構に重要な役割を持つと考えられている。平成24年度では、クサフグの4種類のCry遺伝子（Cry1、Cry2、Cry3、Phr（光修復酵素））をクローニングし、このうちCry3遺伝子の発現が間脳で日周変動することを明らかにした。平成25年度では、Cry3遺伝子に加えて、Cry1遺伝子の発現も間脳において日周変動することが分かった。また、恒暗条件下でも24時間周期の変動を示すことが分かり、Cry遺伝子はクサフグにおいても概日時計遺伝子として機能することが示唆された。さらに、中枢概日時計があると考えられる網膜において、Cry1、Cry3、Phrの各遺伝子は転写後にスプライシングを受けず、これらの遺伝子産物はN末端領域だけからなる機能欠損型のCryであることが示唆された。
2）クサフグの産卵行動の調査や産卵魚の採集、胚と稚魚の飼育を行うための新たな研究フィールドの探索を行った。静岡県伊東市川奈海岸と兵庫県神戸市舞子海岸のクサフグの産卵場があることが分かり、川奈海岸において産卵行動の調査を行うと共に産卵魚を採集した。また、舞子海岸では産卵場を確認した。さらに、東京大学大学院理学系研究科附属臨海実験所（神奈川県三浦市）の産卵場で産卵魚を採集し、人工授精して成体まで飼育した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
計画から遅れている部分として，MelR遺伝子の5’上流域をレポーター遺伝子につないだDNAコンストラクトとOtx5遺伝子の5’上流域をGFP遺伝子につないだDNAコンストラクトの作製がまだ完了していない。また，血液中のメラトニンの測定について、血液のクロロホルム抽出による測定を検討しているが、安定した測定条件は得られていない。一方で，計画より進んでいる部分として，概日時計遺伝子として機能していると考えられるCry遺伝子が網膜で機能欠損型の産物として合成され、クサフグでは網膜の中枢概日時計の機能が通常と異なることが示唆された点が挙げられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
計画より遅れている部分について、DNAコンストラクトの作製を進める。また、クサフグの胚から成体までを飼育することが可能になったので、胚から成体の松果体におけるMelR、Otx5、Cryの各遺伝子の周期的発現を解析する。平成26年度では、松果体に存在する15時間周期の新規体内時計の分子的実体を明らかにするため、次世代シークエンサーによるRNAシークエンス解析を行う。そのため、成熟魚を採集、飼育して一定時間ごとに松果体を採集し、RNAシークエンスの材料とする。また、これらの松果体機能の解析に加えて、網膜におけるCryの機能について解析する。特に、非スプライシング遺伝子産物量の周期的な変動を解析する。
研究費の使用について、当初の計画では平成26年度に行うRNAシークエンス解析を外部業者に受託するため、その経費（90万円）をその他として計上していた。しかし、本解析を平成26年度東京大学大気海洋研究所共同利用研究として行うことが可能になり、その経費分を本研究課題の中の他の解析のための物品費と旅費にあてる。
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