2014 Fiscal Year Research-status Report
錐体・桿体視細胞に特異的な光応答をもたらす分子環境の解析
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24570085
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
橘木 修志 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (70324746)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 動物生理化学 / 視細胞 / 錐体 / 桿体 / 光応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、錐体・桿体の光受容部（外節）でのi)脂質組成の違い、ii)発現しているタンパク質の違い、の２つの違いに注目し、これらの違いが錐体・桿体の光応答特性の違いをもたらしているかどうかを明らかにすることを目的としている。
着目している2つの項目のうち、前者(脂質組成の違い)に着目した理由は、この違いが視細胞における視物質のGタンパク質活性化の効率に影響を及ぼし、最終的に錐体・桿体の光応答の感受性の違いの原因となると考えられるからである。前年度までに、錐体・桿体の外節における脂質組成や脂肪酸組成に違いがあることを示唆するデータを得たが、今年度は、さらに解析を重ね、脂質組成については、コレステロール量が錐体において桿体より有意に高いこと、脂肪酸組成については特定の不飽和脂肪酸（DHA）の割合が桿体では錐体よりも有意に高いことを定量的に明らかにした。
着目している2つの項目のうち、後者（発現しているタンパク質の違い）については、これまでに二次元電気泳動法によって解析を行ってきた。しかしながら、解析を重ねるうちに、二次元電気泳動法ではゲルに取り込まれるタンパク質量が限られることから、網羅的な解析が行いにくいことがわかった。そこで現在、より多くのタンパク質を検出することができるゲルショットガン解析に方法を変えて実験を行っている。得られるMSデータを効率よく解析のために、コイ網膜のmRNAライブラリも構築し、コイ視細胞外節に発現しているタンパク質を高効率で網羅的に解析できるようになった。
さらに、錐体と桿体において異なった種類が発現しているアレスチンについて、錐体・桿体での働きが異なるかどうか検討した所、新規の作用機序を見出し、これを学術誌に発表した。また、錐体特異的な発色団再生機構に関与する酵素の同定を行い、これを学術誌に発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の計画では、平成２６年度において、計画1)錐体・桿体の脂質組成の違いが視物質のTr活性化に与える影響の評価を終了させ、(計画2)錐体・桿体いずれかの外節のみに存在するタンパク質の評価を主に行うことを予定していた。
計画１）昨年度は、錐体と桿体とで脂質組成がどのように違うのかを定量的に確定することが出来た。錐体・桿体の外節膜脂質組成を再現するうえでの重要な知見が得られたことになる。現在、それぞれの組成条件の環境下で、視物質によるTr活性化反応の効率を測定する作業を行っており、今年度の早い時期で結果を得られると予想できる。今後は、得られた結果をすみやかに発表する予定である。
計画２）一昨年度までに解析法として二次元ゲル電気泳動法を用いていたが、実験を進める中で、実際に得られるタンパク質情報が限られることに気づいた。現在、方法を改善した解析（ゲルショットガン法による解析）を行っており、得られる情報量の飛躍的な増大を見ている。現在の優れた方法により、より詳細な解析が可能となっており、いくつか錐体・桿体特異的なタンパク質の候補も得られているので、今後、すみやかにそれぞれの局在・機能の確認をしたい。本年度に結果を発表する。
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| Strategy for Future Research Activity |
（今後の計画１）昨年度までに得られた知見に基いて、錐体・桿体の外節における脂質組成や脂肪酸組成が視物質のGタンパク質活性化の効率に影響を及ぼすかどうかの検討を行い、早期に研究計画を完了する。
（今後の計画２）改善された方法（ゲルショットガン法）によって得られる結果に基づき、錐体・桿体特異的タンパク質の候補をより多くリストアップした後、その中で注目すべきものについての組織内局在・および細胞内局在を免疫組織染色法で確認し、本当に外節特異的なタンパク質であるかどうかを検証する。また、同定されたタンパク質の機能について検討を行い、早期に研究を完了する。
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| Causes of Carryover |
実験手法（脂質、タンパク質の解析方法）を見直すことにより、実験に必要な試料の量を大幅に減らすことが出来た。これに伴って、実験試料である視細胞を採取するための実験動物の購入料を抑制することが出来るようになった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
現在進行している錐体・桿体の脂質組成、およびタンパク質の解析の結果をまとめ、研究の成果を学術雑誌に投稿する予定である。未使用額は、継続実験の費用、および雑誌への投稿料として用いる。
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