2014 Fiscal Year Annual Research Report
酵素の局在と機能特化：テトラヒメナ繊毛膜に局在するＡＫ酵素をモデルとして
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24570087
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
鈴木 知彦 高知大学, 自然科学系, 教授 (60145109)
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2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ミリストイル化 / 酵素の局在 / アルギニンキナーゼ / アルギニンリン酸シャトル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
テトラヒメナ（Tetrarhymena pyriformis）には単量体のAK（AK1）と2ドメイン型のAK（AK2）の両方が存在しており，AK1は主に繊毛に，AK2は細胞質に局在することが分かっている．両者は繊毛内において，「アルギニンリン酸シャトル機構」に深く関わり，繊毛運動のエネルギー供給に深く関与している．また， AK1は，N末端にミリストイル化シグナル配列を持ち，そのN末端ペプチドがN-ミリストイルトランスフェラーゼによって実際にミリストイル化されることから，生体内においても修飾されている可能性が高い．
より直接的にAK１のミリストイル化を証明するために，昆虫細胞由来の無細胞タンパク質合成系（島津製作所）を用いて，ミリストイル化されたAK1を直接合成した．先ず，C末にStrepタグを付加したAK1のcDNA配列を全合成した．次に，そのmRNAを大量に合成し，ミリストイルCoAを含む無細胞系に加えた．この系で合成されたAK1は，付加されたStrepタグを用いて純度よく精製することができた．さらに，SDS電気泳動を行い，合成されたAK1を切り出してMALDI-TOF-MS分析（トリプシン消化産物の質量分析）を外注した．比較のために，Tetrahymena AK1と同様にミリストイル化シグナル配列を持つ２種類のフォスファゲンキナーゼを合成し，併せて質量分析を行った．その結果，後者の２種類については，ミリストイル化されたN末端トリプシンペプチドの質量が0.1 Da以下の誤差で検出された．しかしながら，Tetrahymena AK1については，上記に相当する質量は観測されなかった． Tetrahymena AK1のペプチド質量の回収率が低かったことを考え合わせると，これはターゲットのペプチドがイオン化されなかった可能性を示唆する．今後条件を変えた分析が必要である．
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[Journal Article] Two arginine kinases of Tetrahymena pyriformis: characterization and localization.2014
Author(s)
Michibata, J., Okazaki, N., Motomura, S., Uda, K., Fujiwara, S. and Suzuki, T.
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Journal Title
Comp. Biochem. Physiol. Part B.
Volume: 171
Pages: 34-41
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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