2014 Fiscal Year Annual Research Report
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24570125
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
米沢 直人 千葉大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (80212314)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柳田 光昭 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80365569)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 糖タンパク質 / 受精 / 透明帯 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類卵子透明帯は3ないし4種類の糖タンパク質で構成されており、受精の際に種選択的精子認識、先体反応誘起、多精拒否などの役割を果たす。ブタとウシでは構成糖タンパク質はZP2, ZP3, ZP4の3種類であり、ZP3とZP4との複合体形成が精子結合能に必要である。
(1)ウシZP3/ZP4複合体形成部位と精子結合部位の同定を目指した。ウシZP3およびZP4の種々の変異タンパク質をバキュロウイルス-Sf9細胞発現系を用いて発現させた。ZP3のN末端からヒンジ領域までの領域にZP4結合部位の少なくとも一カ所が存在し、特にヒンジ領域の五アミノ酸残基が重要であることを見出した。一残基ずつAlaに変異させることによりZP4結合残基の同定を試みたがZP4結合には影響を与えなかった。N末端側サブドメインを緑色蛍光タンパク質(GFP)あるいはマルトース結合タンパク質(MBP)に置換しヒンジ領域が単独でZP4結合能を示すかどうかを調べたところ、GFPはそれ自身がZP4結合能を示したがMBPはZP4結合能を示さず、MBPとヒンジ領域との融合タンパク質を用いることによりヒンジ領域が単独でZP4結合能を有することを証明した。
(2)化学架橋剤sulfo-SBEDを用いてブタ精子上の透明帯結合タンパク質の同定を試みた。見かけの分子量約20,000のタンパク質が架橋されることを見出し質量分析まで進めたが、この架橋の再現性が不十分であることが判明した。
(3)多精拒否機構解明を目指し、ZP2の受精に伴うプロセシングの試験管内再構成を試みた。ZP2のプロセシング部位をエンテロキナーゼ、Tevプロテアーゼ、Factor Xa切断配列に置換し市販酵素による切断効率を比較した。Factor Xa配列がプロセシングには比較的適していることがわかった。
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