2014 Fiscal Year Annual Research Report
珍しい特徴を有する二つの酵素の立体構造に基づく触媒機構解明とその利用
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24570130
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
藤橋 雅宏 京都大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (10397581)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ODCase / OMPDC / OMPDCase / 基質の歪み / X線結晶構造 / 国際情報交換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ODCaseについては、2012年度に生成物Uridine monophosphate (UMP)との複合体構造を1.03Å分解能で決定した。この分解能は、これまでにタンパク質構造データベースに登録されているODCaseの200以上の構造の中で、群を抜いて高い分解能である。この構造と、表面プラズモン共鳴法による分析を組み合わせ、Lys72とUMPが互いに斥力を及ぼし合っていることを示し、論文にまとめた。2013年度には、8つの酵素-基質アナログ複合体構造と反応素過程の計算機シミュレーションを組み合わせ、ODCaseの基質であるOMPはcarboxylate基がpyrimidine環から回転し、平面から歪んだ状態で結合し、反応が進行することを示した。シミュレーション結果から、基質歪みの反応への貢献は少なくとも10-15%程度はあることがわかった。
2014年度には、活性中心に存在するアスパラギン酸残基と、基質OMPのcarboxyl基の間に静電的な反発があるのかを確かめるため、より高分解能でのX線構造解析や中性子線による構造解析を目指した。このため、結晶格子形成に関わる残基に変異を導入したり、大量の精製試料を得る方法の開発に努めた。また、日本語と英語それぞれの総説を執筆した。
Cyc2については、当初Bacillus subtilis 由来の酵素の結晶化及び構造解析を目指してきた。2012年度の研究により、連携研究者により確立されていた方法で精製した酵素は、不均質な多量体を形成しており、結晶化には適していないことが明らかになった。2013年度には発現用タグの見直しや精製法の改良を行ったが、性状の改善には成功しなかった。2014年度には、配列類似の酵素のうち、結晶化に適しているものの検索を行った。その結果、Bacillus属の別の種由来の酵素が比較的性状が良いことがわかった。今後、この酵素の結晶化に取り組む計画である。
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