2014 Fiscal Year Research-status Report
補酵素Ｂ１２関与ラジカル酵素の活性維持システムの動作原理の解明
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24570161
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
森 光一 岡山大学, 自然科学研究科, 助教 (50379715)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
飛松 孝正 岡山大学, 自然科学研究科, 准教授 (30188768)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ビタミンB12補酵素 / ラジカル触媒酵素 / メチルマロニルCoAムターゼ / MMAA蛋白質 / メチルマロン酸尿症 / ジオールデヒドラターゼ / グリセロールデヒドラターゼ / エタノールアミンアンモニアリアーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1．MMAAの大腸菌での発現系の改良。発現量改善を目的として、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）との融合蛋白質の発現系の構築を行ったが、大きな改善は見られなかった。次いで、ヒト由来であるMMAA遺伝子を大腸菌での発現に適したコドンに改変した人工遺伝子（以下eMMAA）を合成し、pET-21bベクターに組み込んで発現プラスミドを作成した。これをBL21 Star(DE3)株等の発現用大腸菌宿主に導入し、30℃で発現を行ったところ、MMAA蛋白質の発現量は増加したものの、封入体を形成して不溶性画分に存在する量が多かった。そこで、低温での発現、pColdベクターを用いた発現、GST やマルトース結合タンパク質との融合蛋白質としての発現、分子シャペロン（GroEL, GroES, DnaK, DnaJ, GrpE）との共発現を検討した。このうち、可溶性画分へのMMAA蛋白質の発現量が最も多かった分子シャペロンとの共発現株の菌体破砕上清からNi-NTAアガロースカラムカラムを用いてHisタグ付きMMAA蛋白質の精製を行った。精製画分にGroELと考えられる蛋白質の共雑が認められたことから、共発現させる分子シャペロンを再度検討し、MMAA蛋白質の可溶性発現にはDnaK, DnaJ, GrpEだけで有効であることを明らかにした。
2．サブユニット融合型グリセロールデヒドラターゼ（GD）類似酵素の研究。サブユニット構造や活性部位アミノ酸の一部に既知GDとは異なる特徴をもつ根粒菌Mesorhizobium loti由来GD類似酵素について、pET-21bを用いた発現系構築を前年度に行ったが、封入体の形成やサブユニット毎の発現量のばらつきなどの問題があったので、発現系の改良を行った。サブユニット遺伝子の順番やプロモーターの追加などによって問題が解決出来たので、発現を行い蛋白質精製を行った。同様に、サブユニット融合型に改変したKlebsiella pneumoniae由来GDの発現系を構築し、蛋白質精製を行った。これらについて酵素活性の確認を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の計画では、平成26年度までにメチルマロニルCoAムターゼ（MCM）に対するMMAAの機能の解明を完了するはずであったが、MCM，MMAAのどちらについても大量に蛋白質を得るための大腸菌発現系の完成に予想以上に時間を要した。平成25年度にMCM、平成26年度にMMAAの大量発現系が完成し、蛋白質精製までは行うことが出来たが、機能解析はこれからである。
DDRによるDDの再活性化機構の研究は、ATP結合型DDRの結晶構造解析は出来なかったものの、変異型DDRおよびDDを用いた生化学的研究により、再活性化に重要なアミノ酸残基の役割を明らかにすることが出来たことでほぼ目的が達せられたと考えられる。
エタノールアミンアンモニアリアーゼ（EAL）の再活性化および補酵素B12再生系酵素に関する研究は、MCMの実験を優先させたために進展させることが出来なかったが、すでにある程度の結果は得られていることから近い将来に研究結果を発表することは可能である。
また、当初の実験計画にはなかったものであるが、M. loti由来サブユニット融合型GD類似酵素についての研究を行った。これまでに大腸菌での発現系の構築と酵素精製が完了しており、予備的ではあるが、既知GDとの差異が明らかになりつつある。この酵素は幾つかの特徴から既知GDのような不活性化を受けにくい可能性もあると考えられ、これを調べることで不活性化や再活性化を含む補酵素B12関与ラジカル酵素の活性維持システムを理解する上で重要な知見が得られると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
（今後の推進方策）
1．精製MMAAおよびMCMを用いてMMAAによるMCMの再活性化を確認する。次いで、再活性化機構を調べる。具体的には、ゲル濾過クロマトグラフィーや非変性ポリアクリルアミドゲルゲル電気泳動などを用いてMCM-MMAA複合体の形成やGTPやGDPの効果を検討する。さらに不活性化されたMCMのMMAAによるアポ化の有無などを調べ、MMAAによるMCMの再活性化機構を明らかにする。さらに、cblA型メチルマロン酸尿症の患者に見られる変異型MMAAについても同様に機能解析を行い、変異が機能にどのように影響するのかを明らかにする。
2．M. loti由来サブユニット融合型GD類似酵素（MloGD）の機能解析を行う。具体的には、精製MloGDを用いて基質特異性の解析、既知GDとは異なる基質を用いた場合の酵素反応生成物の同定、反応速度・不活性化速度の測定を行う。また、サブユニットの会合状態などについて、サブユニット分離型に改変したMloGDや既知GDとの比較を行う。
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| Causes of Carryover |
大腸菌を用いたヒトMCMおよびMMAA蛋白質の大量発現が当初の想定以上に困難であり、効率的な発現系の構築に時間を要した。その結果、本研究の完成に必要な実験を予定期間内に完了することが確定的となったので、必要な実験を平成27年度に行えるよう予算の一部を次年度用に残した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ヒトMCMおよびMMAA蛋白質の精製及び機能解析、変異型MMAA蛋白質の作成、MloGDの機能解析に必要な試薬類やその他の消耗品の購入、外注のDNA シークエンス解析などに充てる。
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