2014 Fiscal Year Annual Research Report
１分子蛍光観察手法を用いた分化初期化の単一細胞エピジェネティクス
| Project/Area Number |
24570191
|
|---|
| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
|---|
Principal Investigator |
藤田 英明 独立行政法人理化学研究所, 生命システム研究センター, 客員研究員 (50318804)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
|
| Keywords | Histac / ヒストン / アセチル化 / 蛍光観察 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
エピジェネティカルな変化を一分子蛍光観察で捉えるため、理研で開発されたヒストンのアセチル化を観測可能なプローブHistac（BRDTのブロモドメイン両端にそれぞれCFPとVenusを融合したFRETプローブ）のVenusを光活性化が可能なPAGFPに、CFPをSNAP-tagに置き換えたプローブを作成した。このプローブを恒常的に発現するHEK293T細胞を作成し、TMRSTAR（SNAP-tagに結合する赤色色素）によって染色した。PAGFP－TMRSTAR間でFRETが起きていることを確認するため、PAGFPを活性化させたのち、TMRを褪色させたところGFPの蛍光が増大することが確認され、作成したプローブ内でFRETが起きていることが確かめられた。この改変したHistacがヒストンアセチル化のプローブとして働いているかどうかを確認するため、細胞を1μMのトリコスタチンＡ（TSA）にて３時間処理したところ、FRET効率の上昇が確認されたことから改変Histacがヒストンアセチル化のレポーターとして使えることが確かめられた。次に、このプローブが１分子観察可能であるかを調べるため、染色した改変Histac発現HEK293T細胞をPALM顕微鏡により観察したところ、4000以上の輝点が単一核中に観察された。GFPの蛍光はTMRによる染色によって有意に落ちることから、FRETが起きているここがわかる。
次に、ES細胞分化によるエピジェネティカルな変化を捉えるため、改変HistacをマウスES細胞に導入した。TSA処理によってFRET効率の上昇が見られたことから、開発したプローブはES細胞内においてもヒストンアセチル化状態を観察可能であることが確認された。一方、観察される輝点の数はHEK293T細胞よりも少なく、核あたり~1000個程度であった。ES細胞の培養はLIFを加えた状態と、分化後の状態としてLIFを除いた環境下で１週間培養したものを用意し、FRET効率の違いを調べたが有意な差は見られなかった。
|
