2014 Fiscal Year Research-status Report
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24570203
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| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
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Principal Investigator |
定塚 勝樹 基礎生物学研究所, 多様性生物学研究所, 助教 (40291893)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 染色体 / クロマチン / 細胞分裂 / 分子生物学 / 遺伝学 / 染色体構造 / 分配 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では出芽酵母をモデルに、染色体凝縮でコンデンシンが如何にしてクロマチンDNAをコンパクトに凝縮するのか、その機構の解明を目的としている。
出芽酵母でコンデンシンは、①セントロメア、②腕部に散在するtRNA遺伝子(tDNA)、及び③リボソームRNA遺伝子(rDNA)領域にあるRFBに結合する。それらの中でRFBは最も多くコンデンシンを結合する部位である。本研究では、任意の染色体腕部に2～3コピーのRFBを並べ、コンデンシンに依ってRFB間の相互作用が生じる可能性を3C法によって調べた。成果として、分裂中期では、コンデンシン結合に依り２つのRFBが相互作用して、その間のクロマチンが折りたたまれることを見出した。これが染色体凝縮の素反応の１つと考えられる。また、間期でもRFB間相互作用が検出されること、そして分裂中期になると相互作用を示すシグナルが増加する様子が観られた。さらに分裂後期に移行すると相互作用を示すシグナルがさらに増大することに加え、RFBに挟まれた領域との相互作用を示すシグナルも増大することが解った。以上の結果から、間期でもクロマチンDNAは一定程度折りたたまれた状態で、分裂期ではより高密度に折りたたまれると考えられる。さらに、分裂後期では、RFB間の相互作用だけではなく、RFBに挟まれた領域のクロマチン同士が複雑に相互作用して、RFBを基とした単純なループ構造から、より複雑な状態へと移行していると考えられる。
また、染色体腕部に２つのRFBを並べた細胞を長時間培養により休止期に移行させ3C法を行った。その結果RFBにコンデンシンが結合する細胞では、休止期にRFB間相互作用を示す強いシグナルが観られた。以上の結果から、増殖期および休止期のいずれにおいても、コンデンシンが特定のDNA部位に結合することに依って、その結合部位同士のクロマチン間相互作用が促進され、染色体凝縮が誘導されることが解った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度、人工的に染色体腕部に挿入したRFB配列間での相互作用が細胞周期でどの様に変化するのかを明らかにすることを目的とした。3C法でクロマチン間の相互作用を解析した結果、間期から分裂中期に移行すると、RFB間での相互作用が増大することが解った事から一定の目的を達成している。一方、分裂後期に停止させた細胞を使った3C解析では、相互作用を示すシグナルのさらなる増大が観られたものの、この結果は単純に間期、分裂中期の結果と比較できる段階には至っていないと判断している。3C法ではタンパク質とクロマチンDNAとの結合をホルマリンによってクロスリンクすることで解析するが、このクロスリンク反応は温度により大きく影響を受ける。間期、分裂中期で停止させた細胞の調整は、低温（26度）で培養した細胞を用いてクロスリンク反応を行っている。一方、分裂後期で停止させるために、温度感受性変異（cdc15）を使い高温（37度）で培養した細胞を用いてクロスリンク反応を行っている。この温度条件の違いがどの様に影響しているのかを検討する必要が残っている点で、やや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
温度の違いによるによるクロスリンク反応の影響を検討するため、以下の方策を行う。
RFBへのコンデンシンの結合には、リクルーターとして働く少なくとも4種のタンパク質を同定している。このリクルーター遺伝子の欠失によってコンデンシンがRFBに結合できない細胞をコントロールとして、低温及び高温条件下でクロスリンク反応を行い3C解析を実施する。この欠損株ではRFBへのコンデンシンの結合が生じないことから、コンデンシンに依存したRFB間の相互作用は変化がないと考えられる。そこで、低温及び高温条件下でのリクルーター遺伝子欠失株を使った相互作用シグナルの変化を、温度の違いによるクロスリンク反応の影響と考え、その変化分を正常細胞を使って得られた結果から補正する事で、低温条件と高温条件を比較する。
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| Causes of Carryover |
クロマチン相互作用検出において、反応温度の違いによる条件検討に必要が生じたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当初予定していた酵素・試薬類を次年度に購入して計画を進める。
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