キュウリモザイクウイルス感染による宿主植物の抗ウイルスＰＴＧＳ抑制機序の解明

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24580069
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Osaka Prefecture University
• Principal Investigator: 大木 理 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (00128761)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: タバコ / PTGS / VIGS / キュウリモザイクウイルス / ウイルスサプレッサー

Research Abstract

H24年度は，①CMV感染による導入遺伝子誘導型PTGS抑制実験系の確立（GF-IRタバコの作出），および，②CMV感染が誘導するVIGSの抑制実験の確立（CMV-GFの作出）を行った．
①に関しては当初，ハイグロマイシン耐性遺伝子を持つバイナリーベクターにGFP遺伝子のGF領域の逆位反復配列をクローニングし，カナマイシン耐性遺伝子を既に持つGFP恒常発現タバコに導入する予定であったが，この方法では二重組換え体を得ることができなかった．そこで，カナマイシン耐性遺伝子を持つバイナリーベクターにGF領域の逆位反復配列をクローニングして野性型タバコに導入し，GF-IRラインを2ライン作出した．そして，これらGF-IRラインとGFP恒常発現タバコを交配してGF-IR/GFPタバコ種子を得た．
②に関しては，当初，CMVペポRNA3の感染性クローンの外被タンパク質遺伝子の下流にGF配列を導入する予定であったが，約500塩基のGF領域を導入するとCMVの感染性が喪失した．そこで，30塩基のGFP配列をRNA3に導入し，野性型RNA1と，野性型RNA2，RNAサイレンシングサプレッサーである2bタンパク質を欠く∆2b-RNA2，あるいはサプレッサー活性を喪失させる変異を2bに導入したR46C-RNA2とともに，GFP恒常発現タバコに接種した．野性型2bを持つCMV-GFは明瞭なモザイク症状を示し，モザイク葉緑色部位においてGFP蛍光の消失が観察された．∆2bおよびR46C-2bを持つCMV-GFはタバコに病徴を示さず，ウイルスを接種した個体のほぼ全ての上位葉でGFP蛍光の消失が観察された．以上から，CMV RNA3に導入した30塩基のGFP配列で十分にVIGSを誘導できること，モザイク葉緑色部位では全体にVIGSが誘導されていることが示された．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

実験①，実験②ともに当初予定した方法ではPTGSおよびVIGSを誘導することができなかったが，若干の修正を加えることにより，H24年度実験の目的である，GF-IR導入遺伝子が誘導するPTGS実験系，およびCMVに導入したGFP配列が誘導するVIGS実験系の確立を達成することができた．

Strategy for Future Research Activity

CMV感染による導入遺伝子誘導型PTGS抑制実験では，H24年度に作出したGF IR/GFPタバコ，およびGFPの過剰発現によるPTGSが誘導されたタバコ（S-PTGSタバコ）に，野性型CMV，CMV ∆2b，およびCMV R46Cを接種し，ウイルス感染タバコにおける病徴発現とGFP蛍光の有無を継時的に観察する．さらに，マクロ蛍光観察システムによりGFP蛍光消失部分，および蛍光部分からサンプリングを行い，それぞれの組織におけるGFP mRNAの蓄積量，および，GF領域（GFP遺伝子の前半約500塩基）由来siRNAとP領域（GFP遺伝子の後半約300塩基）由来siRNAの蓄積量をノーザンブロット法により解析する．野性型の2bを持つCMV感染組織においてP領域由来siRNAの蓄積が抑制されていた場合，CMVの2bは二次PTGSをしていることが証明される．
CMV感染が誘導するVIGSの抑制実験では，H24年度に作出したCMV-GF，CMV ∆2b-GF，および，CMV R46C-GFをGFP恒常発現タバコに接種し，その後の病徴発現とGFP蛍光の有無を継時的に観察する．さらに，CMV感染葉におけるCMV RNA，CMV由来siRNA，GFP mRNA，GF領域由来siRNA，および，P領域由来-siRNAの蓄積量をノーザンブロット法により解析する．VIGS実験系では，30塩基のGFP配列でRNAサイレンシングを誘導しているので，GF領域およびP領域由来siRNAの蓄積が抑制されていた場合，CMVの2bは二次VIGSをしていることが証明される．

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

H24年度の実験では，GF-IRタバコの作出，および，CMV-GFの作出に時間を要したため，これら実験材料を用いた解析まで行うことができなかった．従って，ノーザン法等に使用するための研究費を次年度に持ち越した．H25年度に行う解析では，マクロ蛍光観察システムを用いてGFP蛍光消失部分，および蛍光部分からサンプリングを行う．より正確で鮮明な画像の取得と正確なサンプリングを行うために，広視野ズームレンズ（VB-G05）の購入に研究費を使用する予定である．