2014 Fiscal Year Annual Research Report
代謝および転写機構改変によるメタノールを原料にした高物性ＰＨＡ生産菌の育種
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24580103
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
折田 和泉 東京工業大学, 生命理工学研究科, 助教 (70525964)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | メタノール / ポリヒドロキシアルカン酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
次世代資源として有用なメタノールを原料に微生物産系の生分解性ポリエステルであるポリヒドロキシアルカン酸（PHA）の高物性共重合体を効率的に生合成する菌株を作製することを目的として、従来の代謝工学的手法とσ70をコードするrpoD遺伝子をランダム変異させることで包括的に転写機構を改変する革新的な手法を用いた分子育種を行った。分子育種の宿主には代表的なメタノール資化性菌であるMethylobacterium extorquensを用いた。
代謝工学的手法を用いた育種では、第二モノマー前駆体供給酵素遺伝子の高発現と前駆体がPHA合成以外に使われる経路の遮断を行った。その結果、前者では第二モノマー分率が増加したが、後者ではメタノール生育能を失った。これはモノマー前駆体がメタノール生育に必須な代謝経路上の化合物であることに起因している。そこで、経路遮断株をコハク酸培養した後にメタノール培養する二段培養を行った結果、第二モノマー分率がメタノール培養時に著しく増加した。また、育種の過程で、本菌はコバルトイオン欠乏時に生育の低下に伴い、第二モノマー分率が増加することを明らかにした。
包括的転写機構改変では、ランダム変異やスクリーニングの方法を検討し、メタノール資化性菌ではじめて本法を確立した。エラープローンPCRとMEGA primer WHOLe Plasmid (MEGA-WHOP)法により取得したrpoD変異ライブラリーでM. extorquensを形質転換し表現型に基づくスクリーニングによりPHA蓄積率やメタノール生育能が向上した菌株を取得した。さらに、取得したプラスミドを鋳型にしたランダム変異を行い、高濃度メタノール存在下でPHA蓄積率が増加した菌株を得た。現在、トランスクリプトーム解析のための条件検討を行っている。
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