2012 Fiscal Year Research-status Report
セルロース資源からのバイオリファイナリー構築のための酵素基盤研究
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24580120
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Ishikawa Prefectural University |
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Principal Investigator |
熊谷 英彦 石川県立大学, 生物資源環境学部, 特任教授 (70027192)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 憲二 石川県立大学, 生物資源環境学部, 教授 (70109049)
片山 高嶺 石川県立大学, 生物資源環境学部, 准教授 (70346104)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | バイオエタノール / Kluyveromyces / 糖化同時発酵 |
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| Research Abstract |
セルロースは，地球上に最も多く存在する未利用で再生可能な資源である．しかしながら人類はまだこの資源を石油に代わるエネルギー源あるいは化学合成原料として有効に利用できるシステムを手に入れていない．本研究では，セルロースを原料とし，経済性のある資源循環型システム（バイオリファイナリーシステム）を実現するための基盤研究として，耐熱性セルラーゼに着目し，その高活性化・高安定化およびその大量生産システムを構築することを目的としている．
平成２４年度においては，耐熱性酵母Kluyveromuces marxianusを使用した糖化同時発酵システムを作製することを試みた．まず，Kluyveromuces marxianusゲノム上に耐熱性カビ由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子を導入し，本酵素を菌体外に大量分泌させることに成功した．次に，組換え菌株を用いてセロビオース（セルロースをセルラーゼで処理した際に産出される主反応物であるが，同時にセルラーゼの阻害剤ともなるために，速やかに分解させることが望まれている）からのエタノール発酵を試みた．また，発酵槽からのエタノール回収も試みた．その結果，発酵槽に空気を通気することで，理論収率の約２０％の効率でセロビオースから純粋なエタノールを回収することに成功した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
異種セルラーゼを発現させた酵母を利用した同時糖化発酵(Consolidated bioprocess)は，セルロースからのバイオエタノール生産を行う上で近年最も注目を集めている手法である．しかしながら，現在までの手法においては，発現させるセルラーゼの耐熱性が高くなく，また， Saccharomyces serevisiaeを使用していたため，発酵槽を３０度付近に調整せねばならず，このことがコスト面で大きな問題となっていた．本研究課題では，耐熱性酵母Kluyveromuces marxianusおよび耐熱性β-グルコシダーゼを利用することで，４５度において糖化同時発酵が可能なことを示すと共に，発酵槽のpHを５付近に維持すれば，空気を通気するだけで，純粋なエタノールが得られることが明らかとなった（他の有機酸などは，pH5付近では脱プロトン化している）．以上の成果は，国際誌Journal of Bioscience and Bioengineeringに掲載されるとともに， Renewable Energy Global InnovationsにFeatured articleとして紹介された．
また，これとは別に，耐熱性β-グルコシダーゼの更なる耐熱化に取り組んだ．エラープローンPCRの結果，５カ所のアミノ酸置換で耐熱性の向上が認められた．
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| Strategy for Future Research Activity |
上記の耐熱性β-グルコシダーゼを組み込んだKluyveromyces marxianusゲノムに，耐熱性セロビオヒドロラーゼおよび耐熱性β-グルカナーゼを導入し，菌体外に大量発現させる手法を開発する．さらに，作製した組み換え株を使用して，セルロースからの糖化同時発酵を試みる．β-グルコシダーゼの耐熱性変異体については，現在までに，５カ所のアミノ酸置換を確認している．この５カ所において飽和変異（すべてのアミノ酸残基に置換する手法）を導入し，どのアミノ酸置換が良いかを決定し，また，それらの変異を組み合わせることで，最終的に本酵素の耐熱性を１０度上昇させることを試みる．更に，耐熱性向上のメカニズムをX線結晶構造解析から明らかとする．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
消耗品―耐熱性酵素の構造機能解析を中心とした研究計画とし，必要な消耗品（オリゴ糖・プラスチック製品・遺伝子解析用試薬）を購入する．
出張費―構造解析は，高エネルギー加速器研究機構（筑波）で行うため，出張費を計上する．
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