2014 Fiscal Year Research-status Report
酵母の新規イオン輸送体の解析とオルガネラ膜のイオン輸送体測定技術の基盤構築
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24580135
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
浜本 晋 東北大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (10533812)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / 酵母液胞膜 / 電気生理学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、酵母の巨大化法と酵母液胞膜を用いたパッチクランプ法の併用により、酵母液胞膜に局在するCa2+チャネルYVC1の機能解明、yvc1欠損株の液胞膜に真核生物の細胞内小器官に局在するイオン輸送体を導入発現して機能解析することをめざした。動物においてセンサータンパク質として機能するイオンチャネルTRPのホモログチャネルであるYVC1は、動物TRPチャネルの分子機構を明らかにするための重要な研究対象である。これまでに細胞質内の還元剤によってYVC1チャネルが活性化されることが報告されていたが、どのような分子機構によって活性化しているかは未知であった。本研究では、YVC1チャネルのシステイン残基をセリン残基に置換して還元剤による活性化の有無を確認したところ、C末端領域のシステイン残基が活性に重要であることを見いだした。また、リン脂質がYVC1の活性化を抑制する可能性を示唆するデータが得られた。
yvc1欠損株にシロイヌナズナのゴルジ体に発現する陰イオンCLCDに緑色蛍光タンパク質GFPを融合したCLCD-GFPを形質導入し、共焦点顕微鏡を用いて観察したところ、yvc1欠損株の液胞膜から蛍光シグナルを検出した。さらに、CLCDチャネルを発現した酵母液胞膜を用いてパッチクランプ解析を行ったところ、細胞質から液胞内に向かって透過するCl-電流を検出した。以上より、ゴルジ体に局在するイオン輸送体の異種発現系として酵母液胞膜を用いることが可能と考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究により、細胞質内の還元剤によるYVC1チャネル活性化の分子機構の詳細を明らかにした。また、シロイヌナズナのゴルジ体に局在する陰イオン輸送体CLC-dを酵母に形質導入して局在を検討したところ、酵母液胞膜への局在を確認した。シロイヌナズナのゴルジ体に局在するイオン輸送体CLC-dが酵母に導入発現した場合に、酵母液胞膜に局在することが明らかとなり、さらにCl-を選択的に透過することが示された。また、前年度の研究では、ヒト細胞のリソソームに局在する陽イオンチャネルを酵母液胞膜を用いて機能解析することに成功している。以上より、酵母の液胞膜が真核細胞のオルガネラ膜に局在するイオンチャネルの機能解析系として有用であることを示した。
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| Strategy for Future Research Activity |
YVC1チャネルにおいて還元剤による活性化に寄与するシステイン残基の生理的意義を検討するために、yvc1欠損株にYVC1チャネルもしくはシステイン変異型YVC1チャネルとイクオリンタンパク質を共発現させることにより、それぞれのチャネルの細胞質へのCa2+放出活性への影響を検討する。
これまでの研究により、酵母液胞膜が真核細胞のオルガネラ膜に局在するイオンチャネルの機能解析系として有用であることを示した。一方で、本研究を推進するにあたり、酵母液胞膜への発現が確認されなかったイオンチャネルも複数確認している。酵母液胞膜への局在を確認したイオンチャネルと局在しなかったイオンチャネルを比較することにより、特定のペプチド配列が液胞膜への局在に寄与している可能性を見出した。本ペプチド配列を酵母液胞膜に局在しなかったイオンチャネルに付与することにより酵母液胞膜への局在を示すか検討する。
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| Causes of Carryover |
平成２６年度に実施した電気生理学的測定により、酵母液胞膜から未知のイオン電流を検出したため、予定していた遺伝子に加え、さらに複数の遺伝子を同時に破壊する必要が生じた。平成２６年度に予定していた遺伝子破壊を次年度に行うために、平成２６年度に購入を予定していた遺伝子工学実験試薬を次年度に購入することとした。さらに、遺伝子破壊株を用いた電気生理学的解析を翌年度に行うために、電気生理学実験用消耗品と酵母培養用培地を翌年度に購入する。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
電気生理学実験によるイオンチャネル活性の測定を予定しているため、ガラス器具、プラスチック器具、電子部品を消耗品として購入する。電気生理実験に用いる巨大化酵母の調製などに必要な培地試薬、化学薬品、酵素試薬んどの消耗品を購入する。遺伝子破壊株の作成、遺伝子発現量の確認、遺伝子工学実験試薬を購入する。成果発表となる国際誌への論文投稿をめざし、英文校正代と投稿料を必要とする。国内の学会と国外の学会に積極的に参加し、本研究の成果を発表するために出張経費が必要となる。
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[Journal Article] The jasmonate-responsive GTR1 transporter is required for gibberellin-mediated stamen development in Arabidopsis.2015
Author(s)
Saito, H., Oikawa, T., Hamamoto, S., Ishimaru, Y., Kanamori-Sato, M., Sasaki-Sekimoto, Y., Utsumi, T., Chen, J., Kanno, Y., Masuda, S., Kamiya, Y., Seo, M., Uozumi, N., Ueda, M., and Ohta, H.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 6
Pages: 6095-6106
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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