2015 Fiscal Year Annual Research Report
酵母の新規イオン輸送体の解析とオルガネラ膜のイオン輸送体測定技術の基盤構築
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24580135
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
浜本 晋 東北大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (10533812)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / 酵母 / 液胞膜 / 細胞内小器官 / パッチクランプ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、酵母の巨大化法と細胞内小器官を用いたパッチクランプ法の併用により、酵母液胞膜に局在するCa2+チャネルTRPY1の機能解明、trpy1欠損株の液胞膜に真核生物の細胞内小器官に局在するイオン輸送体を導入発現して機能解析することをめざした。
高等動物において外環境からの刺激に応答するイオンチャネルTRPのホモログチャネルであるTRPY1は、動物TRPチャネルの分子機構を解明するための重要な研究対象である。これまでにTRPY1が還元剤によって活性化が報告されているが、その活性化機構の詳細は未知のままである。本研究では還元剤が作用するアミノ酸残基を同定するために、細胞質に露出したN末端とC末端のシステイン残基をセリン残基に置換して活性を測定したところ、C末端のシステインをセリンに置換した変異チャネルでは還元剤による活性化が消失した。また、その変異チャネルではCa2+による活性化には変化は見られなかった。測定電極の先端に液胞膜の断片を移しとるexcised-patch法を用いた単一チャネル測定を行い、野生型TRPY1と変異TRPY1を比較したところ、単一チャネルのコンダクタンスに違いは見られなかった。次に、各種のホファチジルイノシトールリン酸を細胞質側に添加したところ、 PI(3)PによってTRPY1の活性化が半分程度に減少した。その一方、PI(3,5)P2とPIでは活性に変化は見られなかった。TRPY1は、高浸透圧に応答して液胞内から細胞質へCa2+を放出することが知られているため、イクオリンを用いた細胞内Ca2+検出実験を行った。その結果、PI(3)Pを脱リン酸化してPIを生合成するSac1脱リン酸化酵素の欠損株では液胞内からのCa2+放出がみられなかった。このことより、PIPの蓄積がTRPY1活性を抑制することが推察された。
trpy1欠損株の液胞膜にシロイヌナズナの陰イオンチャネルCLC-Dを導入発現して機能解析したところCLC-DのClイオンの透過を確認した。
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