2012 Fiscal Year Research-status Report
分解耐性型細胞膜透過性タンパク質による細胞分化／寿命制御システムの開発
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24580148
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
舛廣 善和 日本大学, 生物資源科学部, 講師 (00336083)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
関 泰一郎 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (20187834)
花澤 重正 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (60060258)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 細胞膜透過性タンパク質 / iPS細胞 / 肝細胞分化 / Treg分化 / 長寿 / Sirt / Stabilon / タンパク質分解耐性 |
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| Research Abstract |
細胞膜透過性有用タンパク質（細胞分化／長寿に関する）の発現系を構築を試みた。
アレルギー性疾患時に起きる炎症を抑制する目的で、Treg細胞（Th2細胞を抑制する）を誘導もしくは活性化可能な転写因子Foxp3について細胞膜透過性タンパク質発現系（大腸菌）を構築した。発現は良好で１LiterのLB培地培養で数ミリグラムの発現がみられた。しかし、尿素変性状態でNiレジンで精製した後の透析によるリフォールディングで数パーセントの可溶化度であったため、今後のin vivoの実験への応用は難しいと考える。また、本研究室で見出したStabilonタグはFoxp3に対しては極めて有効であり、HEK293やHeLa細胞で３～１５倍の安定化が可能であった。
また、iPS誘導の山中因子に関しては４因子およびGlis1の細胞膜透過性タンパク質の発現系を構築した。４因子は発現が良好であったが、Glis1は分解産物が多く見られた。現在、４因子は１０ミリグラムオーダーの大量調製を行い、ほぼ精製が完了している。Glis1は分解産物が少なくなる条件を検討中である。また、Sox2とGlis1はStabilon融合により細胞内で安定化した。
iPS細胞から肝臓の分化を誘導する系では、まず、内胚葉への分化を可能にするSox17のクローニングを行った。また、内胚葉から肝細胞を誘導するHNF3betaもクローニングした。大腸菌発現系を構築したがこれらは極めて発現が悪かった。
長寿を可能にするSirt1に関してはクローニングができなかった。この因子は2400bpと極めて長く、クローニングが難しかった。
分解耐性モチーフStabilonのメカニズムについてはStabilonによるプロテアソーム分解耐性を調べた。in vitroプロテアソームアッセイの結果、プロテアソーム分解耐性の可能性が高いことが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Foxp3発現系は今後の実験に十分なタンパク質量の発現系を構築できた。また、Stabilonによる細胞内での安定化に成功した。iPS誘導を行うYamanaka因子およびGlis1に関しても、誘導実験に十分な大量のタンパク質発現系を構築できた。また、Sox2とGlis1に関しては、Stabilonによる細胞内での安定化に成功した。肝細胞誘導のSox17, HNF3betaのクローニングと発現ベクターの作製に成功した。Stabilonモチーフによる融合タンパク質の安定化機構の一端を解明した。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞膜透過性Foxp3に関しては、リフォールディング効率が少ないことが問題であることから、大型のゲル濾過カラムを用い脱塩によるリフォールディングを試み、活性型タンパク質の効率のよい回収法の開発を試みる。iPS細胞に関しては精製した細胞膜透過性タンパク質と試薬の組み合わせで誘導実験を行い、遺伝的に安全、かつ簡易な誘導法の確立を試みる。Glis1に関しては、低温誘導や菌株を代えるなどの対策を考える。肝細胞誘導に関してはSox17とHNF3betaの発現しやすい条件を検討する。N末の不要領域を削ることを考える。Sirtに関してはクローニングを試みる。難しい場合、市販品も考える。Stabilonのメカニズムに関しては、精製市販品を用い、プロテアーゼ分解耐性を調べる。また、SUMO化修飾の関与が疑われるため、このメカニズムも探る。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
全て物品費として使用し、主に分子生物学用の試薬や培地、ディッシュ、ピペット、チューブ類の購入に充てる。
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