2013 Fiscal Year Research-status Report
分解耐性型細胞膜透過性タンパク質による細胞分化／寿命制御システムの開発
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24580148
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
舛廣 善和 日本大学, 生物資源科学部, 講師 (00336083)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
関 泰一郎 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (20187834)
花澤 重正 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (60060258)
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| Keywords | Stabilon / 分解耐性 / 細胞膜透過性 / 細胞機能調節 / 細胞分化調節 / RAR / 制御性T細胞 / iPS細胞 |
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| Research Abstract |
本研究では分解耐性型細胞膜透過性有用因子（細胞分化／機能制御因子）の発現系を構築し、細胞機能や分化を制御できるシステムの構築を試みている。
大腸菌発現プラスミドに分解耐性モチーフ、細胞膜透過性モチーフ、有用因子cDNA組み込み、融合タンパク質発現プラスミドを構築した。分解耐性モチーフには本研究室で見出したStabilonモチーフを使用した。細胞膜透過性モチーフには脂溶性アミノ酸からなるMTMモチーフを使用した。
iPS細胞は今後再生医療に有望だと考えられている。再生医療に応用するためには、遺伝的に安全かつ簡易な作成法が必用である。本研究ではタンパク質によるiPS誘導法の確立を目指している。山中因子およびある転写因子を組み込みBL21(DE3)に発現させた。多くの因子は発現が良好であったがGlis1は分解もしくは合成途中の産物が多かった。また、全てのタンパク質は封入体に発現させ、グアニジン塩酸変性条件下でNiレジンにより精製を行い、透析によりリフォールディングした。多くの因子はリフォールディング過程の工夫により、可溶性タンパク質として巻き戻せたが、Oct4-MTMはリフォールディング効率が悪かった。
免疫寛容に重要な働きをする制御性T細胞（Treg）を誘導する転写因子Foxp3についても同発現系の構築を試みた。本タンパク質はBL21(DE3)による発現は良好であったが、透析によるリフォールディング過程でアグリゲーション（再凝集）を起こした。これは本タンパク質が塩基性が強いためであると考えられる。様々な透析条件を試した結果、ある試薬による有望な条件を絞り出せた。
白血病の治療に応用するためのRARタンパク質は現在発現プラスミドを構築中である。
現在、可溶化に成功したこれらのタンパク質のin vitroおよび培養細胞レベルでの機能解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現在、非常にたくさん（約４０種類）の組換え体タンパク質の産生を行っている。発現が良好でグアニジン塩酸変性条件から透析でのリフォールディングが良好なタンパク質に関しては解析も順調に進んでいるが、発現が不良（分解がみられる、発現量が少ない等）なタンパク質やリフォールディングがうまくいかないタンパク質が存在した。これらを改善するため、発現時の温度や菌株、IPTG（発現誘導試薬）濃度、誘導時間等の条件検討を行ったり、リフォールディング条件の検討（タンパク質濃度、温度、共存試薬の検討）を行ってきた。しかし、うまくいかないタンパク質に関しては、条件検討してもうまくいかない場合が多く、時間がかかっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
iPS細胞の誘導に関しては、既にリフォールディングがうまくいったタンパク質を用い、誘導を試みる。既に線維芽細胞からの誘導を２回実験を行い、方向性は見えてきている。今後、組み合わせ条件を更に検討し、高効率で簡易な誘導法の開発を試みる。また、in vitro、培養細胞レベルでの機能解析も完全なものに仕上げる。更に、bFGFとCCL2の発現系も構築する。Foxp3に関しては、現在の条件では再現性がとれていないため、再度実験を行い、可溶化タンパク質の産生条件を決定する。産生後はTh0からTreg細胞を誘導可能かを調べる。また、EMSAによるDNA結合能、Luciferase assayによる転写活性測定も行う。RARに関しては、早期にStabilon融合発現系を構築する。非融合体に関しては既に産生済で機能解析も終えていることから、同時に比較実験を行う。また、白血病細胞を有為に成熟白血球に誘導可能化を確かめる。
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