植物ホルモン応答の新規シグナル伝達制御メカニズムの解明

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24580149
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Nagahama Institute of Bio-Science and Technology
• Principal Investigator: 亀村 和生 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 准教授 (00399437)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 今村 綾 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 講師 (50410965)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 翻訳後修飾 / O-GlcNAc / ヒストン / エピジェネティックコード

Research Abstract

平成24年度の研究実施計画に基づき、シロイヌナズナ培養細胞から内在性O-GlcNAc修飾タンパク質の生化学的同定を試みた。培養細胞、あるいはカルスから調製した細胞溶解サンプルに対し、抗O-GlcNAc抗体（モノクローナル抗体CTD110.6、ならびにRL2）を用いたウエスタンブロッティングにより、O-GlcNAc修飾タンパク質をサーベイした。その結果、複数の抗O-GlcNAc抗体陽性タンパク質の存在を認めた。同サンプルから、小麦胚芽アグルチニンアフィニティークロマトによりO-GlcNAc修飾タンパク質の精製を試みたが、本法では特異タンパク質の精製は困難であった。この原因として、細胞溶解サンプル中に夾雑する糖類が考えられた。そこで、細胞溶解方法を変更し、細胞分画して核画分ならびに細胞質画分を調製し、このうち特に核画分に注目してO-GlcNAc修飾タンパク質の存否を検証したところ、分子量10-20 kDa付近に2種の抗O-GlcNAc抗体陽性タンパク質の存在を認めた。核画分に豊富に存在する分子量10-20 kDaのタンパク質としてヒストンが挙げられるので、粗ヒストン画分を調製して検証したところ、ヒストンH3が抗O-GlcNAc抗体陽性を示すことを突き止めた。動物細胞においては、ヒストンのO-GlcNAc修飾はエピジェネティックコードとして注目を集めている。本研究において、植物細胞においてもエピジェネティックコードとしてO-GlcNAc修飾が用いられている可能性を示す最初の知見となりうる。よって、今後この点に特に注目して解析を進める予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究の目的は、O-GlcNAc修飾に着目し、全く新しい切り口から植物ホルモン応答のシグナル伝達制御メカニズムの解明に迫ることである。平成24年度の研究実施計画では、シロイヌナズナ培養細胞、ならびにカルスを材料として内在性O-GlcNAc修飾タンパク質候補を同定することを目指しており、現在までにヒストンH3を候補タンパク質として同定できている。よって、概ね当初の計画通りに遂行しているといえる。

Strategy for Future Research Activity

当初設定した平成25年度の研究実施計画に基づき、シロイヌナズナ培養細胞由来ヒストンH3につき、真にO-GlcNAc構造の糖修飾を有することを化学的に証明する。これと並行して、SPY/SECの標的となる植物ホルモン応答性O-GlcNAc修飾タンパク質を同定する。培養細胞、あるいはカルスに対し、ジベレリン、サイトカイニンなどの植物ホルモンを処理した後に細胞溶解サンプルを調製し、植物ホルモン未処理サンプルとの間でO-GlcNAc修飾レベルが変動するタンパク質をウエスタンブロッティングにより解析するとともにLC-MS/MSにより同定する。植物ホルモン処理については、処理濃度や処理後回収までの時間などを幅広く設定し、それに伴うO-GlcNAc修飾変動を逐一精査する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

次年度使用額として\46,652の研究費を生じた。これについては、次年度研究実施計画の更なる充実を図るため、次年度に請求させていただく研究費に加算し、消耗品費として特に生化学関連試薬の購入に充てさせていただきたい。