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2012 Fiscal Year Research-status Report

エビ類におけるワクチン効果判定ツールの探索‐哺乳類の抗体に代わる指標はあるのか?

Research Project

Project/Area Number 24580273
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Research InstitutionUniversity of Miyazaki

Principal Investigator

伊丹 利明  宮崎大学, 農学部, 教授 (00363573)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 酒井 正博  宮崎大学, 農学部, 教授 (20178536)
Project Period (FY) 2012-04-01 – 2015-03-31
Keywordsクルマエビ / ワクチン / 抗体用因子 / サイトカイン / 受容体
Research Abstract

DNAワクチンを投与し、血球遊走性を確認したクルマエビの血液から、縮重プライマーを用いてマクロファージ遊走阻止因子(MIF)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、骨形成因子(BMP)およびMstn(骨格筋形成抑制因子)関連遺伝子を分離し、全長を明らかにした。これらの因子は哺乳類におけるサイトカインとしての機能を持っており、甲殻類からは初めての報告である。これらのサイトカインは炎症反応における白血球動員、免疫反応の調節、マクロファージ系細胞の遊走促進など免疫反応と深く関係している。これらのサイトカイン様遺伝子の感染時における発現解析を行ったところ、VEGFは細菌感染の初期に約30倍に、またウイルス感染では後期に約80倍に発現が上昇することが解った。一方、Mstnではこれらの感染において、感染後期に約1/100に発現が抑制されることが解った。これらの結果から、VEGF,とMstnは細菌やウイルスによる感染に対して鋭敏に反応していることが解った。さらにdsRNAをクルマエビに注射して、これら遺伝子をノックダウンを試みたところ、遺伝子はノックダウンされ、注射後10日後にはいずれのノックダウン区のクルマエビも死亡率が対照区より高かった。このことからも、これらのサイトカイン様遺伝子はクルマエビの恒常性維持に不可欠であることが明らかとなった。MIFについて立体構造予測を行ったところ、単量体だけでなく、比較的安定な3量体の立体構造が予測された。また、VEGFについて立体構造予測を行ったところ、2量体の構造が予測できた。
自然免疫関連遺伝子の網羅的定量解析に用いる、マルチプレックスRT-PCR用のプライマーセットを整備し、細菌感染ではTollとToll2遺伝子などが特異的に発現することが明らかとなった。ウイルス感染ではDicer2とArgonaute2遺伝子が特異的に発現することを明らかとした。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

今回、ワクチン効果判定のために上記4種類のサイトカイン様遺伝子を明らかにした。現在さらに6種類以上のサイトカイン様遺伝子の解析を行ったおり、当初計画以上に進行している。さらに、自然免疫関連遺伝子の網羅的定量解析に用いる、マルチプレックスRT-PCR用のプライマーセットに上記サイトカインを加えたセットも作製でき、各遺伝子発現解析用のプライマーをリアルタイムPCRによって検証できた。

Strategy for Future Research Activity

現在上記サイトカイン様遺伝子のタンパク発現をバキュロウイルスプロモーターを用いた昆虫細胞系で行う予定にしている。従来の大腸菌系の発現系を用いると、痕跡程度にのこるLPSによって、クルマエビの血球が反応することが危惧されるので、バキュロプロモーター系を使うこととした。すでに予備実験を行っており、タンパク作製の目途はついている。一方、VEGFの受容体(VEGFR)に関する遺伝子情報も入手できたので、VEGFRのタンパク発現をCHO細胞系を用いて発現させる予定にしている。本年度はワクチン評価に用いることのできるサイトカイン因子をタンパクレベルで発現させ、リガンドと受容体の関連性を詳細に調査する。
同時にこれらサイトカイン様遺伝子をマルチプレックスRT-PCR用のプライマーセットに加えたセットをワクチン投与エビで再度検証して、現在対象としてるサイトカイン様遺伝子以外の遺伝子で、ワクチン応答に関与する遺伝子の洗い出しを行う。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

平成24年度の成果を6月25~28日にスペインで開催される”The International Society of Fish and Shellfish Immunology”で発表する。さらに、上記サイトカイン様遺伝子のバキュロウイルスプロモーター系を用いたタンパク発現と受容体のCHO細胞上での発現を行って、リガンドと受容体の相互関係を明らかにする。これらの結果から、ワクチン評価に最適なサイトカインあるいはその受容体を選択し、指標とする。これらの基礎的実験に基づいた結果からマルチプレックスRT-PCRによる網羅的遺伝子発現システムによって検出可能かどうかを検討する。

  • Research Products

    (16 results)

All 2013 2012 Other

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (11 results) Remarks (1 results) Patent(Industrial Property Rights) (2 results)

  • [Journal Article] Deciphering of the Dual oxidase (Nox family) gene from kuruma shrimp, Marsupenaeus japonicus: full-length cDNA cloning and characterization2013

    • Author(s)
      M. Inada, K. Kihara, T. Kono, R. Sudhakaran, T. Mekata, M. Sakai, T. Yoshida, T. Itami
    • Journal Title

      Fish & Shellfish Immunology

      Volume: 34 Pages: 471-485

    • DOI

      10.1016/j.fsi.2012.11.026

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The SOCS and STAT from JAK/STAT signaling pathway of kuruma shrimp Marsupenaeus japonicus: Molecular cloning, characterization and expression analysis2013

    • Author(s)
      S. Okugawa, T. Mekata, M. Inada, K. Kihara, A. Shiki, K. Kannabiran, T. Kono, M. Sakai, T. Yoshida, T. Itami, R. Sudhakaran
    • Journal Title

      Molecular and Cellular Probes

      Volume: 27 Pages: 6-14

    • DOI

      10.1016/j.mcp.2012.08.003

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] クルマエビ (Marsupenaeus japonicus) のサイトカイン遺伝子群に関する研究 I ―細胞遊走・増殖 (および血管新生) に関わるサイトカインについて―2013

    • Author(s)
      稲田真理、木原啓輔、湯井敏文、河野智哉、吉田照豊、酒井正博、伊丹利明
    • Organizer
      平成25年度 日本水産学会春季大会
    • Place of Presentation
      東京都
    • Year and Date
      20130324-20130328
  • [Presentation] クルマエビ (Marsupenaeus japonicus) のサイトカイン遺伝子群に関する研究 II2013

    • Author(s)
      稲田真理、木原啓輔、湯井敏文、河野智哉、吉田照豊、酒井正博、伊丹利明
    • Organizer
      平成25年度 日本水産学会春季大会
    • Place of Presentation
      東京都
    • Year and Date
      20130324-20130328
  • [Presentation] multiplex RT-PCR法を用いたクルマエビ生体防御関連遺伝子群の網羅的定量発現解析I ―細菌感染―2013

    • Author(s)
      木原啓輔、稲田真理、志岐綾香、重吉大輔、米加田 徹、河野智哉、吉田照豊、酒井正博、伊丹利明
    • Organizer
      平成25年度 日本水産学会春季大会
    • Place of Presentation
      東京都
    • Year and Date
      20130324-20130328
  • [Presentation] multiplex RT-PCR法を用いたクルマエビ生体防御関連遺伝子群の網羅的定量発現解析II ―ウイルス感染―2013

    • Author(s)
      木原啓輔、稲田真理、志岐綾香、重吉大輔、米加田 徹、河野智哉、吉田照豊、酒井正博、伊丹利明
    • Organizer
      平成25年度 日本水産学会春季大会
    • Place of Presentation
      東京都
    • Year and Date
      20130324-20130328
  • [Presentation] クルマエビ (Marsupenaeus japonicus) のサイトカイン遺伝子群に関する研究 III ―造血に関わるサイトカインについて―2013

    • Author(s)
      稲田真理、木原啓輔、湯井敏文、河野智哉、吉田照豊、酒井正博、伊丹利明
    • Organizer
      平成25年度 日本水産学会春季大会
    • Place of Presentation
      東京都
    • Year and Date
      20130324-20130328
  • [Presentation] クルマエビ (Marsupenaeus japonicus) のPRDV感染とアポトーシスおよびJAK/STAT経路、RNA干渉に関わる遺伝子群の研究2012

    • Author(s)
      稲田真理、木原啓輔、志岐綾香、重吉大輔、吉田照豊、酒井正博、伊丹利明、河野智哉
    • Organizer
      平成24年度 日本水産学会秋季大会
    • Place of Presentation
      下関市
    • Year and Date
      20120914-20120917
  • [Presentation] クルマエビ (Marsupenaeus japonicus) のフリーラジカル生成遺伝子群に関する研究2012

    • Author(s)
      重吉大輔、吉田照豊、酒井正博、伊丹利明、稲田真理、木原啓輔、志岐綾香、河野智哉
    • Organizer
      平成24年度 日本水産学会秋季大会
    • Place of Presentation
      下関市
    • Year and Date
      20120914-20120917
  • [Presentation] Molecular cloning, expression analysis and knockdown of nadph oxidase gene, MjNOX, in kuruma shrimp Marsupenaeus japonicus2012

    • Author(s)
      M. Inada, R. Sudhakaran, K. Kihara, J. Nishi, M. Yoshimine, T. Mekata, T. Kono, M. Sakai, T. Yoshida, T. Itami
    • Organizer
      AQUA2012 Global Aquaculture – Securing our Future
    • Place of Presentation
      Praha, Czech
    • Year and Date
      20120901-20120905
  • [Presentation] Molecular Cloning and Expression Analyses of Free Radical Generation Enzymes in Kuruma Shrimp Marsupenaeus japonicus2012

    • Author(s)
      M. Inada, K. Kihara, A. Shiki, T. Kono, T. Yoshida, M. Sakai, T. Mekata, R. Sudhakaran, T. Itami
    • Organizer
      The 12th Congress of the International Society of Developmental and Comparative Immunology
    • Place of Presentation
      Fukuoka, Japan
    • Year and Date
      20120709-20120713
  • [Presentation] Gene knock down and mRNA variants of Astakine, ancient cytokine, in Kuruma Shrimp Marsupenaeus japonicus2012

    • Author(s)
      M. Inada, K. Kihara, A. Shiki, T. Kono, T. Yoshida, M. Sakai, T. Mekata, R. Sudhakaran, T. Itami
    • Organizer
      The 12th Congress of the International Society of Developmental and Comparative Immunology
    • Place of Presentation
      Fukuoka, Japan
    • Year and Date
      20120709-20120713
  • [Presentation] Interaction between WSSV infection and Apoptosis-, JAK/STAT-signaling- pathway- and RNAi-related Genes in Kuruma Shrimp, Marsupenaeus japonicus2012

    • Author(s)
      M. Inada, J. Nishi, M. Yoshimine, K. Kihara, A. Shiki, T. Kono, T. Yoshida, M. Sakai, T. Mekata, R. Sudhakaran, S. Okugawa, T. Itami
    • Organizer
      The 12th Congress of the International Society of Developmental and Comparative Immunology
    • Place of Presentation
      Fukuoka, Japan
    • Year and Date
      20120709-20120713
  • [Remarks] 無脊椎動物バイオディフェンス研究室

    • URL

      http://www.agr.miyazaki-u.ac.jp/~fishery/staff/staff07/

  • [Patent(Industrial Property Rights)] マルチプレックス遺伝子解析によるエビ類の健康診断法2013

    • Inventor(s)
      伊丹利明、木原啓輔、稲田真理、酒井正博、河野智哉
    • Industrial Property Rights Holder
      国立大学法人宮崎大学
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      特願2013-014265
    • Filing Date
      2013-01-29
  • [Patent(Industrial Property Rights)] LAMP法による急性ウイルス血症原因ウイルスの検出方法及び検出試薬キット2012

    • Inventor(s)
      伊丹利明、酒井正博、河野智哉、米加田徹
    • Industrial Property Rights Holder
      国立大学法人宮崎大学
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      特願2012-192077
    • Filing Date
      2012-08-31

URL: 

Published: 2014-07-24  

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