2014 Fiscal Year Research-status Report
二枚貝における未受精卵成熟調整因子の探索とその応用
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24580296
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| Research Institution | Tohoku Seikatsu Bunka Junior College |
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Principal Investigator |
永沼 孝子 東北生活文化大学短期大学部, その他部局等, 講師 (50250733)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小川 智久 東北大学, 生命科学研究科, 准教授 (80240901)
村本 光二 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (90157800)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | レクチン / 二枚貝 / タンパク質 / 生殖腺 / 生体防御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度にマベガイ外套膜より単離した９種のレクチンのうち、最初に生理機能の一部を解明することができた、グラム陰性菌と相互作用を持つ２種について、発現部位と局在を明らかにする目的で抗体作成を試みた。これらの抗体について全９種のレクチンを用いてウェスタンブロットを行なった結果、同時に精製した数種のレクチンと交叉反応がみられ、in situ hybridization を行なうことができなかった。P-1, P-2については精製の過程を見直し、アフィニティークロマトグラフィーに続くイオン交換クロマトグラフィーについて再クロマトグラフィーを行なった。SDS-PAGEの結果、単一のタンパク質であると判断されたため、現在サンプル量の確保を行い、再度抗体を作成する準備を進めている。
他のレクチンのうち2種は、分子量とN末端配列から、報告者らが以前から検討しているカルシウム結晶化に関与するレクチンと相同であると判断された。また別の２種（両者とも二量体、分子量：非還元条件下32,000、還元条件下16,000）はマベガイに存在するレクチン中で最大量を示すが、生理機能は未だ解明されていない。微生物との相互作用、カルシウム結晶化への関与は認められないが、生殖腺における未受精卵の成熟調節に関与する可能性は否定できない。両者ともN末端から30個までのアミノ酸配列は一致しており、イオン交換クロマトグラフィーによって2本のピークに分かれた。現在P-1,P-2の全アミノ酸配列を検討中で、2種の相違について検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
目的タンパク質を単離・精製し、発現と局在を調べるために抗体を作成したが、交叉反応が強く現れ、in situ hybridizationを行なうことができなかった。このため目的タンパク質を再度精製しなおす必要が生じた。精製法の見直しを行い、現在純度確認を終えるところであるが、試料に含まれるタンパク質料がもとより少ないこと、試料の採取時期によって収量が変化すること、により十分な量が得られておらず、その先の研究が進捗しなかった。現在、精製法の確認と試料の確保を行なっているところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在検討が進んでいる2種のレクチンについては、抗体を作成して発現・局在を明らかにし、マベガイにおける生体防御機構がどのように働くのかを推察する。また、微生物に対する結合の機構を精査し、病原微生物に対する効果を調べて本レクチンの実用化への一助とする。
マベガイに存在するレクチンのうち最大量を占める2種について局在を明らかにし、未受精卵の成熟調節機能への関与を含めてその生理機能を推察し、確認する。
得られた結果の範囲内でマベガイ中に多種類存在するレクチン群が生体内でどのように役割分担し、また協同しているのかをマッピングする。
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| Causes of Carryover |
目的タンパク質（レクチン）の局在を調べるために抗体を作成したが、交叉反応が強く現れたため、タンパク質の精製法を再検討し、精製度の高い試料を調整して新たに抗体を作成する必要が生じ、その先の研究の進捗状況に影響が及んだ。現在、再精製を行い、試料の量を確保しているところであるが、試料中のタンパク質量が少ないこと、材料の採取時期によって目的物の含量が異なること、から予定よりも進度が遅れている。そのため、研究年度を延長せざるを得ない状況になった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
おおよその使用額は、試料の精製・純度確認に要する試薬、および構造解に使用する共通機器使用料として15万円、抗体作製費用として30万円を見込む。さらに、抗体を使用して免疫組織化学等の検討を行なうための試薬・器具費として25万円、発現試験のための試薬・器具類に30万円を計上した。試料採取のための旅費として10万円、成果発表のための印刷代として5万円を予定している。
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