2014 Fiscal Year Research-status Report
凍結乾燥したウシ精子ならびに二倍体細胞からの胚盤胞作製システム
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24580407
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
保地 眞一 信州大学, 学術研究院繊維学系, 教授 (10283243)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 凍結乾燥 / ケーキ / コラプス / ウシ精子 / Tg' / ICSI / 含水率 / 胚盤胞発生率 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度は、凍結乾燥ウシ精子の発生能に及ぼすコラプスの影響について報告する。
【目的】凍結乾燥を適切な条件下で行うと溶液は多孔質のスポンジ様構造 (凍結乾燥ケーキ) を形成する。しかし、溶液の最大凍結濃縮相ガラス転移温度 (Tg’) よりも高い温度で乾燥を行うと、コラプスと呼ばれる凍結乾燥ケーキの構造崩壊が生じやすい。本研究では、ウシ精子の凍結乾燥ケーキに生じたコラプスが、復水ウシ精子を顕微授精 (ICSI) した後の発生能に及ぼす影響について調べた。【方法と結果】示差走査熱量計 (DSC) を用いて測定した凍結乾燥バッファーのTg’は－28℃だった。凍結融解ウシ精子を同バッファーに懸濁し、予備凍結を行ったのちに－30℃または0℃に制御した凍結乾燥機中で6時間乾燥した。乾燥温度が－30℃の凍結乾燥ケーキは完全な形状を保っていた一方、Tg’より高い0℃で乾燥した場合にはコラプスが生じていた。得られた凍結乾燥ケーキの乾燥度を調べるために含水率の重量測定およびガラス転移温度 (Tg) のDSC測定を行ったところ、0℃で乾燥した場合の含水率は－30℃の場合と比べて約5倍 (3.6 vs. 0.7%, P < 0.05) だったが、Tg測定によりいずれも十分な乾燥状態にあったと確認できた。－20℃で一晩保存した精子をICSIに供して卵子活性化処理を施したところ、卵割率に差は認められなかったものの、培養8日後の胚盤胞発生率については－30℃で乾燥した場合の値 (14%：卵割ベース) が0℃で乾燥したときの値 (1%) よりも有意 (P < 0.05) に高かった。以上、凍結乾燥ケーキのコラプス発生はウシ精子に対する乾燥ストレスを増加させ、ICSI後の胚盤胞発生能を低下させることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ウシ精子の凍結乾燥ケーキに生じたコラプスが復水ウシ精子を顕微授精 (ICSI) した後の発生能に及ぼす影響について調べた。その結果、凍結乾燥ケーキのコラプス発生はウシ精子に対する乾燥ストレスを増加させ、ICSI後の胚盤胞発生能を低下させることを明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
凍結乾燥保存したウシ顆粒膜細胞あるいは繊維芽細胞をドナーとし、DNA損傷に及ぼす凍結乾燥各パラメーターの影響を調べるとともに、体細胞核移植法の適用によって凍結乾燥細胞ドナー核に由来するクローン胚盤胞を作製する。
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