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2012 Fiscal Year Research-status Report

インヒビンの作用機序に関する研究

Research Project

Project/Area Number 24580421
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Research InstitutionTokyo University of Agriculture and Technology

Principal Investigator

新井 浩司  東京農工大学, 農学部, 准教授 (70293016)

Project Period (FY) 2012-04-01 – 2015-03-31
Keywords生理学 / 動物 / 生体分子 / 生理活性 / シグナル伝達
Research Abstract

インヒビンは下垂体からの卵胞刺激ホルモン(FSH)の分泌を特異的に抑制するが、その作用はFSHβ鎖mRNAの3’末端非翻訳領域(3'UTR)を介して発揮されるのではないかとの仮説に基づき、FSHβ鎖mRNAの3'UTRを欠失した変異マウスの作製を試みた。作製法は通常のノックアウトマウスと同様、相同組換えを用いるものであるが、3’UTRのみを欠失させるという特殊なターゲティングベクターの構築が必要とされるためベクター作製に予定よりも時間がかかり、未だ変異マウスの作製には至っていない。現在相同組み換え用のロングアーム部分と、FSHβ鎖mRNAの3’UTRの代わりにLHβ鎖の3’UTRを挿入したDNAをつなぎ合わせたコンストラクトを作製し、そこにネオマイシン発現カセットを挿入した段階である。また、本研究ではインヒビンの作用を検討するために多量のインヒビンを必要とするが、商業的に入手可能なインヒビンが存在しないためCHO細胞での組換え型インヒビンの作製を試み、20クローンを選択した。現在インヒビンの入手が困難であるため、インヒビン高発現株が得られればその有用性は高い。さらにインヒビンと同様の作用を示すフォリスタチンについては高発現CHO細胞株の作製に成功し、簡便な精製法も確立した。また、CMVプロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子を挿入し、さらにFSHβ鎖mRNAの3'UTRを連結したレポーターコンストラクトを作製し、これを下垂体性腺刺激ホルモン産生細胞由来のαT3-1細胞にトランスフェクションしてインヒビンに対する反応性を検討した。その結果、インヒビンによるレポーター遺伝子発現への影響は観察されなかったが、FSHβ鎖mRNAの3'UTRの存在によりmRNAが不安定化することが示唆され、FSHβ鎖mRNAの3'UTRがFSH分泌調節に関与している可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

インヒビンはFSHβ鎖mRNAの3’UTRに作用してその安定性を低下させてFSH分泌抑制作用を発揮しているのではないかとの仮説に基づきFSHβ鎖mRNAの3'UTRを欠失した変異マウスの作製を試みたが、通常のノックアウトマウス作製用ターゲティングベクターの構築と異なり、3’UTRのみを欠失させるというやや特殊なターゲティングベクターの構築が必要とされるため、その作製に予定よりも時間がかかり未だ変異マウスの作製には至っていない。現在、相同組み換え用のロングアーム部分と、FSHβ鎖mRNAの3’UTRの代わりにLHβ鎖の3’UTRを挿入したDNAをつなぎ合わせたコンストラクトを作製し、そこにネオマイシン発現カセットを挿入した段階であり、さらに相同組み換え用のショートアームとネガティブ選択用のジフテリアトキシン発現カセットを挿入する必要がある。

Strategy for Future Research Activity

FSHβ鎖mRNAの3'UTRを欠失した変異マウスを作製するため、変異マウス作製用のターゲティングベクター構築を早急に行う。現在7割方ターゲティングベクターは完成しており、残る作業は通常のターゲティングベクター構築とさほど変わらないためターゲティングベクターを完成させるにはそれほど時間はかからないと予測される。ターゲティングベクター完成後は理化学研究所変異マウス作製ユニットに依頼して目的の変異マウスを作製し、その内分泌学的な特性を明らかにする。また、CMVプロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子を挿入し、さらにFSHβ鎖mRNAの3'UTRを連結したレポーターコンストラクトはαT3-1細胞においてインヒビンに対する反応を示さなかったため、LβT2など他の下垂体性腺刺激ホルモン産生細胞由来の細胞株を検討する必要がある。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

該当なし

  • Research Products

    (7 results)

All 2013 2012 Other

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (4 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Pulsed electric current induces the differentiation of human keratinocytes2013

    • Author(s)
      Arai KY, Nakamura Y, Hachiya Y, Tsuchiya H, Akimoto R, Hosoki K, Kamiya S, Ichikawa H, Nishiyama T
    • Journal Title

      Molecular and Cellular Biochemistry

      Volume: in press Pages: in press

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Ascorbic acid deficiency leads to epidermal atrophy and UVB-induced skin pigmentation in SMP30/GNL knockout hairless mice2012

    • Author(s)
      Sato Y, Arai KY, Nishiyama T, Nomura Y, Kishimoto Y, Aizawa S, Maruyama N, Ishigami A
    • Journal Title

      Journal of Investigative Dermatology

      Volume: 132 Pages: 2112-2115

    • DOI

      10.1038/jid.2012.105.

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] コラーゲン結合ドメインを持つヒトEGFが三次元培養皮膚モデルの表皮重層化におよぼす影響2012

    • Author(s)
      笠原 薫, 重水 洋平, 新井 浩司, 松下 治, 安達 栄治郎, 西山 敏夫
    • Organizer
      第85回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      福岡国際会議場・マリンメッセ福岡,福岡県
    • Year and Date
      20121215-20121215
  • [Presentation] 真皮線維芽細胞含有フィブリンゲルを用いた三次元培養皮膚モデルにおける細胞外マトリックスの産生と沈着2012

    • Author(s)
      小関 理恵子, 菊田 彩子, 八谷 有宇子, 常長 誠, 新井 浩司, 西山 敏夫
    • Organizer
      第85回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      福岡国際会議場・マリンメッセ福岡,福岡県
    • Year and Date
      20121215-20121215
  • [Presentation] IL-1とプロスタグランジンE2を介した表皮ー真皮相互作用2012

    • Author(s)
      新井 浩司, 藤岡 温子, 岡村 良子, 八谷 有宇子, 常長 誠, 西山 敏夫
    • Organizer
      第44日本結合組織学会学術大会、第59回マトリックス研究会大会合同学術集会
    • Place of Presentation
      日本青年館ホテル,東京都
    • Year and Date
      20120607-20120607
  • [Presentation] 収縮フィブリンゲル内培養における皮膚線維芽細胞の細胞外マトリックス遺伝子発現2012

    • Author(s)
      菊田 彩子, 小関 理恵子, 八谷 有宇子, 常長 誠, 新井 浩司, 西山 敏夫
    • Organizer
      第44日本結合組織学会学術大会、第59回マトリックス研究会大会合同学術集会
    • Place of Presentation
      日本青年館ホテル,東京都
    • Year and Date
      20120607-20120607
  • [Remarks] 国立大学法人東京農工大学硬蛋白質利用研究施設

    • URL

      http://www.collagen-institute.jp/

URL: 

Published: 2014-07-24  

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