2014 Fiscal Year Annual Research Report
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24590056
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
木下 誉富 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (90405340)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 病原活性変異体 / 受容体型チロシンキナーゼ / 活性化機構 / Ｘ線結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
受容体型チロシンキナーゼFibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) は細胞外から細胞内へのシグナル伝達を仲介し、繊維芽細胞などの増殖・分化を誘導する。正常組織ではFGFRはリガンドとなるFGF依存的に自己リン酸化して活性化する。一方、ガン組織においてFGF非依存的な恒常的活性を示すFGFR変異体が発見されている。本研究では、Ｘ線結晶構造解析、分子生物学的改変及び酵素機能解析を行い、FGFR3に特有の恒常的活性変異体K650M及びG697Cの活性化メカニズムを原子レベルで解明する。この成果を基盤として、生命維持に必要である野生型に作用せず、恒常的活性変異体にのみ作用する低副作用抗ガン剤の論理的創出を目指す。
これまでに活性機能メカニズムの解析の基礎データとして、野生型及びG697C、K650M、N540T各変異体についてKm値と比活性を求めた。
一方、Ｘ線結晶構造解析に向けて野生型及びG697C変異体について100×50×5 m程度の結晶を得ているが解析レベルに至っていない。そこでH25年度は良好なX線解析実験を行うために各タンパク質サンプルについて、構造の柔軟性が危惧されるC末端領域の切断、遊離システインの置換、発現ベクターの変更を行った。その結果、タンパク質サンプルの収量、純度を改善することに成功した。H26年度はタンパク質の安定性をさらに改善して収率及び純度の向上を目指して、主に発現プロトコールの検討を行った。細胞破砕時にカゼイン及びATPを添加することで、主な不純物として考えられるシャペロン類の除去に成功した。さらに陰イオン交換カラムを用いた精製法を改良し、野生型の非活性体と活性体の分離に成功した。引き続きX線構造解析を行い、これまでに得た酵素機能と合わせて活性変異体の活性化メカニズムを明らかにする。
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