2012 Fiscal Year Research-status Report
インテグリンスプライシングバリアントの機能を利用した新規抗体医薬の創出
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24590072
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
今 重之 北海道大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (90344499)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | インテグリン変異体 / 抗体 / がん転移 |
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| Research Abstract |
申請者はα９インテグリンのスプライシング変異体SFα９を同定しており、細胞外領域のみの構造から形成されるが細胞膜上に発現することを見出している。SFα９は何らかの細胞膜貫通タンパク質と結合することで、細胞膜上に発現すると考えられることから、SFα９タンパク質を精製し、結合蛋白を質量分析法にて探索した。その結果、複数の候補分子を同定することに成功し、現在、実際にSFα９と結合するかを免疫沈降法にて検討している状況にある。また、SFα９に対する特異的モノクローナル抗体を８クローン樹立することに成功した。フローサイトメトリー解析で、野生型α9インテグリンとは反応しないが、SFα９と反応することが分かった。現在、抗SFα９抗体を用いて、SFα9機能を検討している。
細胞内配列が全く異なるマウスα４インテグリン変異体を申請者は同定し、VCAM-1のみと結合するという興味深い結果を得ている。マウスα４インテグリン変異体と野生型α4インテグリンを共発現させた細胞を作製し細胞接着試験を行ったところ、α４依存性細胞接着が抑制されることが分かった。マウスα４インテグリン変異体は野生型α４インテグリンの接着能を抑制する可能性が考えられたことから、次にin vivoにおける機能を検討した。α４インテグリンはメラノーマ細胞B16細胞の肺転移に関与し、抗α４インテグリン抗体で肺転移を抑制できるという報告がある。そこで、マウスα４インテグリン変異体を特異的にノックダウンさせたB16細胞を作製し、肺転移能を検討した。その結果、α４インテグリン変異体ノックダウンB16細胞では、肺転移能が亢進することが分かった。すなわち、α４インテグリン変異体は野生型α４インテグリンに対して抑制的に働ことが分かった。現在、α４インテグリン変異体を特異的に認識する抗体の作製を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
SFα９に関しては、結合タンパク質をLC-MS/MS解析を行うことによって複数同定することができた。さらに特異的なモノクローナル抗体を8クローン作製することに成功した。
また、マウスα４インテグリン変異体に関しては、野生型α４インテグリンとの共発現細胞が、α４インテグリン依存性細胞接着を抑制したことから、マウスα４インテグリン変異体は野生型α４インテグリン抑制分子であることが分かった。さらにin vivoでマウスα４インテグリン変異体機能をマウスメラノーマ細胞株B16細胞で検討した。B16細胞はマウスα４インテグリン変異体と野生型α４インテグリンを共発現している。マウスα４インテグリン変異体のユニークな３’端cDNA配列に対するsiRNAを使用することで、マウスα４インテグリン変異体を特異的にノックダウンさせることに成功した。マウスα４インテグリン変異体特異的ノックダウンB16細胞をマウスに投与した際の肺転移効果を検討した結果、肺転移が亢進することが分かった。すなわち、マウスα４インテグリン変異体はα４インテグリン機能抑制効果を有することが分かった。
またマウスα４インテグリン変異体の細胞内領域KVIL配列をヒトα４インテグリンに導入したヒトα４-KVILを発現する細胞を作製し、ヒトα４-KVILがVCAM-1特異的に細胞接着効果を示すことを見出した。
これら結果は、交付申請書の平成24年度の計画通りに進行しており、おおむね順調に進展していると考えている。ただ、SFα９の結合分子の候補を得ることができたものの、SFα９を細胞膜へ発現させる分子の決定には至っていないことは今度の課題となる。
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| Strategy for Future Research Activity |
SFα９結合分子がSFα９と実際に結合することを免疫沈降で示し、その後、siRNAやshRNAを用いた結合分子特異的ノックダウンにより、SFα９が細胞膜上へ発現しなくなることを示す。また、SFα９結合分子に対する抗体を作製し、α９インテグリン依存性細胞接着への影響を検討する。先日、α９インテグリン依存的にリンパ節転移する乳癌細胞を入手したので、当該乳癌細胞のリンパ節転移に対する抗SFα９抗体やSFα９結合分子に対する抗体の影響を検討する。
マウスα４インテグリン変異体に関しては、これまでの研究で野生型α４インテグリン機能を抑制することを見出した。その結果をさらに確実なものとするため、マウスα４インテグリン変異体を過剰発現させたマウスメラノーマ細胞核B16細胞を作製し、肺転移への影響を調べる。既存の抗α４インテグリン抗体は全てマウスα４インテグリン変異体と野生型α４インテグリン両者を認識してしまい、これまでマウスα４インテグリン変異体と野生型α４インテグリンを特異的に検出する抗体は存在しない。そこで、マウスα４インテグリン変異体と野生型α４インテグリンをそれぞれ特異的に認識する抗体を作製する。
またマウスα４インテグリン変異体の細胞内領域KVIL配列をヒトα４インテグリンに導入したヒトα４-KVILを発現する細胞を抗原として、モノクローナル抗体を得る。目的とする抗体は、α４インテグリンとVCAM-1と特異的に阻害する抗体である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
B-Aの額は3月中あるいは4月上旬に機能解析用消耗品を購入し、既に支払われている。
翌年度分の助成金使用に関しては、平成24年度では、多くの研究ツールを作製することに成功したことから、25年度はin vivoの治療効果が中心となり、動物実験一式（主にヌードマウス）として40万円を使用する。また、モノクローナル抗体作製、培養および精製一式で、40万円使用する。また、SFα９結合分子同定のin vitro実験消耗品として20万円を使用する。
研究成果発表用および情報収集のために「旅費」として10万円使用する。
病態評価用の特殊免疫染色の外注のために「その他」として10万円使用する、
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Research Products
(3 results)
