2012 Fiscal Year Research-status Report
癌化に伴い過剰発現する細胞膜上分子の分子間相互作用と癌形質への影響
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24590082
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Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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Research Institution | Saitama Medical University |
Principal Investigator |
小谷 典弘 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (90342782)
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Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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Keywords | 分子間相互作用 |
Research Abstract |
(1)EML4-ALK肺癌モデルマウスの癌部・非癌部肺組織を用いたcDNAアレイ実験で判明している過剰発現分子のうち、発現が高い順に4つの分子に関してRT-PCRを用いて発現確認を行なった。その結果、Gjb4, Claudin2, CHL1,MMP13の4分子に関して明確な過剰発現を認めた。また、各抗体を用いた組織免疫染色実験を行なった結果、少なくともCHL1及びClaudin2の2分子がタンパク質レベルでも過剰発現していることが判明した。 (2)この2分子に関してEMARSプローブを作成するために、各分子に対する抗体を用いて還元型抗体を作製するための検討を行なった。このうちCHL1抗体に関して、還元型抗体にしてもその活性を失わないことが確認できた。そこで、還元型CHL1抗体のHRP標識体を作成し、抗体結合能を免疫染色にて確認したところ、活性を有していたので、これをCHL1のEMARSプローブとして用いることとした。 (3)作製したEMARSプローブを肺がん初代培養細胞に処理し、fluorescein標識arylazide試薬を用いてEMARS反応を行った。ウエスタンブロット法により、EMARS反応がうまく行われているか判定した結果、CHL1分子の相互作用分子が標識されていることが判明した。これら標識された分子を抗体カラムで精製し、LC-MALDIを用いたEMARS反応標識産物プロテオーム解析法により解析した。その結果、Major urinary proteins 11 and 8が含まれていることが示唆された。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交付申請書に記載している24年度分の実験計画(到達目標)を考慮した場合、標識産物の同定に関しては1つの候補分子を確認したにとどまっているが、CHL1分子の同定及び検証とEMARS反応の実施のところまでは概ね順調である。
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Strategy for Future Research Activity |
25年度に計画している人工相互作用誘導法の開発について計画通り進めると同時に、24年度の課題として残ったEMARS標識産物の同定について、さらに試料を多めに使用することで、複数の相互作用分子を同定したいと考えている。また、初代培養細胞で非がん部細胞を培養するのが困難であることが判明したので、可能であれば非がん部組織の初代培養細胞をmimicした初代培養細胞系をマウスから採取して使用することも計画している。
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Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
研究費に関して、24年度は約80万円程度の持ち越し研究費がある。これは主にLC-MALDIを使用するEMARS標識産物の同定が予想外に手間取ったために、試料の処理に必要な試薬・器具などの購入が滞ったためである。25年度は、引き続きLC-MALDIの使用等を計画しているので、主にこれらをLC-MSの使用に必要な試薬・器具費として使用することを予定している。また、新たに非がん部をmimicした初代培養細胞の採取にも使用したいと考えている。
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