2012 Fiscal Year Research-status Report
酸化ストレス・病態マーカーとなる酸化リン脂質の高感度定量系の構築
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24590094
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Showa University |
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Principal Investigator |
板部 洋之 昭和大学, 薬学部, 教授 (30203079)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 里奈 昭和大学, 薬学部, 助教 (30392400)
小濱 孝士 昭和大学, 薬学部, 助教 (60395647)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 酸化LDL / 酸化リン脂質 / リゾホスファチジルコリン / 動脈硬化症 / LC-MS/MS / PAF-AH |
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| Research Abstract |
LC-MS/MS装置（QTRAP5500）を用いて、酸化LDL中のリン脂質分子種を網羅的に解析した。主要なPCおよび酸化PCをMRM法で、別々に高感度かつ定量的に扱うことができ、硫酸銅によるLDL酸化過程の経時的な変化を分析した。ヒトLDLの酸化反応の進行には30-60分のラグタイムがあり、急激にPUFA含有PC分子種の消失とlysoPCの生成が認められた。lysoPCの生成は、PAF-AH阻害剤のpefablocによりほぼ完全に抑制されたことから、PAF-AHによる酸化PCの加水分解によって生成したものと考えられた。lysoPCの生成に先立って、長鎖型酸化PC分子種の一過的な生成が認められ、PCの酸化変性が、長鎖型酸化PC→開裂型酸化PC→lysoPCへと進行する様子が示された。ウサギLDLについても硫酸銅による酸化過程を調べたところ、ほぼ同様の経過をたどることが分かったが、面白いことにlysoPCの生成量がはるかに少なかった。動脈硬化の好発性との関連が考えられる。PAF-AH阻害剤存在下ではlysoPCの生成が抑制されるにも関わらず、開裂型酸化PCの蓄積はそれほど大きなものではなく、さらに異なる代謝産物に転換している可能性が考えられた。予備的な検討ながら、LDL中の生体内酸化LDLを抗酸化PC抗体で吸着・回収した画分について、含まれるPC分子種を調べてみた。硫酸銅処理で調製した酸化LDL中には著しいlysoPCの蓄積が認められたのに対し、生体内酸化LDL画分にはほとんどlysoPCが認められず、血中では生成したlysoPC が再アシル化するあるいは周囲の細胞などに移行してしまう可能性があると思われた。LDLの参加に伴って生じる酸化リン脂質は、様々なルートで代謝され多様性を増しているものと思われる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成24年度の主要な目標は、LC-MS/MSを用いた酸化ホスファチジルコリンの測定法を導入することである。昨年度は装置の使い方を練習し、予備的な検討をした段階であったが、この1年間で主要なホスファチジルコリン、酸化ホスファチジルコリンの分析パターンがほぼ分かってきて、MRM法による定量的な一斉分析をルーチンに行える体制が整いつつある。ホスファチジルコリンの酸化物の中には、微量の産物も多く、構造未知のものもあり、今後徐々に分析系を向上させていきたい。ヒト血漿中の酸化LDLの分離・回収については、今年度試みていた抗酸化PC抗体を用いた固相吸着法では、スケールアップがやや難しいこと、固相プレートのブロッキング条件がなかなか最適化できないことなどの問題点が生じ、少し異なる手法を試みながら、分離条件を改善する必要がある。これを含めて、酸化ホスファチジルコリン分析の応用を進めることが平成25年度、26年度の目標である。
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| Strategy for Future Research Activity |
生体内酸化LDLの分子種特性を知るために、効率的にLDL画分中の酸化LDL を濃縮・回収する必要がある。これまで試みていた、抗酸化PC抗体を用いた固相吸着法では、スケールアップがやや難しいこと、固相プレートのブロッキング条件がなかなか最適化できないことなどの問題点が生じていた。次年度以降、ゲルろ過カラム、イオン交換カラムによるクロマトグラフィー法も併せて導入し、生体内酸化LDLを分離方法の改善を試みる。これまでにも、小型低比重LDL（sdLDL）や陰性荷電LDL（LDL-）が酸化LDLに相当するのではないかという仮説が議論されてきた。分離方法の改善と併せて、こうしたLDL亜分画との対応関係についても調べて行く。歯肉溝浸出液中に、LDLや酸化LDLが存在することが分かってきた。その構成成分中の酸化PC分子種についてLC-MS解析を試みる。歯肉溝浸出液中の酸化LDLが、血液中の酸化ストレスを反映しているのかどうか検討したい。また、生態環境でのLDLの酸化反応の起こるしくみを明らかにする系としても有用であると考えている。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
物品費（実験器具類、試薬等） 1,200,000円
旅費 （国内旅費）150,000円
その他（論文掲載料、英文校閲料など）250,000円
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Research Products
(9 results)
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[Journal Article] Chronic kidney disease is associated with neovascularization and intraplaque hemorrhage in coronary atherosclerosis in autopsy samples from Japanese elders: the Hisayama Study.2013
Author(s)
Nakano T, Ninomiya T, Sumiyoshi S, Onimaru M, Fujii H, Itabe H, Nakashima Y, Sueishi, K Tsuruya K, Oda Y, Kitazono T, Kiyohara Y.
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Journal Title
Kidney Internatinal
Volume: in press
Pages: in press
Peer Reviewed
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[Journal Article] Positive association between plasma levels of oxidized low density lipoprotein and myeloperoxidase after hemodialysis in patients with diabetic end-stage renal disease.2013
Author(s)
Kitabayashi C, Naruko T, Sugioka K, Yunoki K, Nakagawa M, Inaba M, Ohsawa M, Konishi Y, Imanishi M, Inoue T, Itabe H, Yoshiyama M, Kazuo Haze, Becker AE.
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Journal Title
Hemodialysis International
Volume: in press
Pages: in press
Peer Reviewed
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[Journal Article] Chronic photo-oxidative stress and subsequent MCP-1 activation as causative factors for age-related macular degeneration.2012
Author(s)
Suzuki M, Tsujikawa M, Itabe H, Du ZJ, Xie P, Matsumura N, Fu X, Zhang R, Sonoda KH, Egashira K, Hazen SL, Kamei M.
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Journal Title
J Cell Sci
Volume: 125
Pages: 2407-2415
DOI
Peer Reviewed
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