2014 Fiscal Year Research-status Report
精子幹細胞の異種間移植法とｉｎ ｖｉｔｒｏ培養による精子形成への分化誘導法の確立
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24590243
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
曲 寧 東京医科大学, 医学部, 講師 (70527952)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伊藤 正裕 東京医科大学, 医学部, 教授 (00232471)
善本 隆之 東京医科大学, 医学部, 教授 (80202406)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 精巣 / 抗がん剤 / 精子形成 / サイトカイン / 免疫寛容 / マウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は精子形成誘導に関する精巣内微小環境の要因を調べ、精子形成の促進因子を同定することである。平成２４年度は、抗癌剤ブスルファン処置したマウスの免疫機能を解析し、ブスルファンの免疫抑制への影響を検討した。マウスの免疫機能はブスルファン投与後６０日までに正常にまで回復するが、生殖機能は回復しないことを見出した。これより、生殖細胞が骨髄細胞より回復しにくいことが考えられた。平成２５年度はブスルファン投与における精巣内微小環境の変化と精子形成の機構について解析した。ブスルファンを投与したマウスでは、精細管内Tumor necrosis factor-α (TNF-α)の増加と精巣間質にマクロファージの浸潤がみられた。さらに精子形成を回復させる条件を検討し、精子形成回復したマウスの精巣では精細管内TNF-αと精巣間質にマクロファージの浸潤が低減することを明らかにした。平成２６年度は、前年度に引き続き、精子形成に改善効果のある液性因子の関与や精巣間質マクロファージの関与を検討した。ブスルファン投与による精子形成障害を起こした精巣と精子形成回復した精巣からRNAおよびタンパク質を抽出し、TNF-αやIFN-γなどの炎症性サイトカインとIL-10やIL-35などの抑制性サイトカインの発現をPCR、ウエスタンブロッティングで解析した。現在、差がある分子について、その発現を阻害する抗体や阻害剤を用いて、そのサイトカインの精子形成の関与を解析している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請者らは、以前よりマウスを用いて免疫性精子形成障害の機構や治療応用の可能性について検討を行ってきている。最近、精巣間質のマクロファージから産生される抑制性サイトカインIL-35が、精巣内での免疫寛容の維持に関与している可能性を見出した（PLoS One, 2014 Apr 23;9(4):e96120）。また、以前にマウスとラット間の異種間精原細胞移植の可能性を検討するため、抗癌剤ブスルファン処理により精巣管内の生殖細胞を欠失させた免疫正常マウスに、ラット精原細胞を移植したところ、28例中7例のマウス精巣上体にラット精子が形成されることを見出した。さらに、ラット精原細胞の生着が見られなかったマウスでも、マウスの精子形成が亢進していることを見出した。これよりラット精子形成に伴いラットとマウスに共通の精子形成促進因子が産生されている可能性を見出した。上述の申請者らの最近の結果を基に、精子形成誘導に関する精巣内微小環境の要因を調べ、免疫寛容の誘導機構を解明し精子形成の促進因子の同定を目的とした。本年度の研究結果により精子形成障害の改善作用機序への液性因子の関与が明らかになって、精巣内免疫環境の変化と精子形成の機構解明に有用と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
精子形成を促進する因子の同定するため、精子形成に関わるセルトリ細胞やライディッヒ細胞の関連遺伝子（Germ cell: Tnp1, Spo11, Stra8; Sertoli cell: Amh, Aqp8, Cldn11, Clu, Ccnd2, Espn, Fyn, Inhba, Il1a, Rhox5, Testin, Sox9, Trf; Leydig cell: Hsd3b6, Star, Lhr, Pdgfa）（O’Shaughnessy et al. Reproduction 135, 839-50, 2008）について調べる。抗癌剤投与における精子形成障害の精巣と精子形成回復した精巣を経時的に摘出し電子顕微鏡切片を作成し、電子顕微鏡解析および免疫組織化学的解析により、ライディッヒ細胞やセルトリ細胞などの精巣組織の微細形態変化の観察を行う。
次年度の研究費の使用計画
平成２７年度は総額500千円の研究経費を計上した。その積算根拠として、実験動物のためのマウス代（食餌含）100千円を計上した。さらに、消耗品として包埋剤・プラスチック・ガラス器具50千円、培養関連試薬100千円、分子生物・生化学関連試薬および免疫・組織学関連試薬および培養関連試薬250千円を計上した。
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| Causes of Carryover |
異種精原細胞移植によりラットとマウスに共通の精子形成促進因子の解明のために、マイクロアレイを予定していたが、Real-Time RT-PCRを用いて実験した。現在まで精子形成に関わるセルトリ細胞やライディッヒ細胞などのmRNAの発現は分かっているものが多く、Real-Time RT-PCRの方が効果的に精子形成促進するポイントを同定できると考えた。
マイクロアレイでは１献体約１０万円強、Real-Time RT-PCRは１献体約5000円と1/20の値段である。また上記は外注した場合の目安であり、Real-Time RT-PCRに関しては、当教室で設備が整っていて自ら実験するため、さらに使用金額が抑えられたことが理由に挙げられる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実験動物のためのマウス代（食餌含）100千円、さらに、消耗品として包埋剤・プラスチック・ガラス器具約50千円、培養関連試薬100千円、分子生物・生化学関連試薬および免疫・組織学関連試薬および培養関連試薬250千円として使用する予定である。
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[Journal Article] Contribution of IL-12/IL-35 ｃommon ｓubunit p35 to ｍaintaining the ｔesticular immune privilege2014
Author(s)
Terayama H, Yoshimoto T, Hirai S, Naito M, Qu N, Hatayama N, Hayashi S, Mitobe K, Furusawa J, Mizoguchi I, Kezuka T, Goto H, Suyama K, Moriyama H, Sakabe K, Itoh M.
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Journal Title
PLoS One
Volume: Apr 23; 9 (4)
Pages: e96120
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Neonatal estrogen treatment with β-estradiol 17-cypionate induces in post-pubertal mice inflammation in the ductuli efferentes, epididymis, and vas deferens, but not in the testis, provoking obstructive azoospermia.2014
Author(s)
Naito M, Hirai S, Terayama H, Qu N, Hayashi S, Hatayama N, Kawamura H, Nakano T, Itoh M.
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Journal Title
Med Mol Morphol
Volume: Mar; 47 (1)
Pages: 21-30
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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