2014 Fiscal Year Annual Research Report
成長円錐の動態の制御機構解析－原子間力顕微鏡によるアプローチ－
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24590248
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
星 治 東京医科歯科大学, 大学院保健衛生学研究科, 教授 (10303124)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
武井 延之 新潟大学, 脳研究所, 准教授 (70221372)
長 雄一郎 東京医科歯科大学, 大学院保健衛生学研究科, 助教 (90334432)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 成長円錐 / 原子間力顕微鏡 / 脳由来神経栄養因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度は、ラット胎児より脊髄後根神経節細胞を採取後、培養した細胞の成長円錐において脳由来神経栄養因子（brain-derived neurotrophic factor; BDNF)の刺激に応答して、局所的蛋白合成がおきているかどうか、新たな方法で検討を行った。さらに、神経節細胞を液中環境で高速原子間力顕微鏡により観察するための走査条件の検討を行った。
【材料と方法】
ラット胎児より脊髄後根神経節細胞を採取し、トリプシン、DNaseⅠ処理後、poly-L-lysineコートのディッシュ上で、8-(4-chlorophenylthio)adenosine-3',5'-cyclic monophosphate (CPT-cAMP)を含む培地で48時間培養した。その後、CPT-ｃAMPを含まない培地で1時間培養後、脳由来神経栄養因子（BDNF）を含む培地で30分間培養し、4%パラホルムアルデヒド溶液で固定後、抗PeEF2(Phosphorylated eukaryotic elongation factor 2)抗体による免疫染色を行った。また、固定後の一部の標本については高速原子間力顕微鏡による観察を行った。
【結果と考察】
抗PeEF2抗体による蛍光免疫染色では、BDNFの刺激がないコントロールの標本と比較して、刺激した標本では蛍光シグナルの低下が認められた。このことよりBDNFに応答して局所的な蛋白合成が増強されていることが示唆された。また、高速走査での原子間力顕微鏡観察については、バネ定数0.3N/mのカンチレバーを用いて、水中でのQ値を20－30とし、タッピングモードによる16秒/フレーム（解像度 256×256ピクセル）の画像取得時間で、明瞭なイメージング像を取得することができた。生きた神経節細胞の高速原子間力顕微鏡によるイメージングを可能にする基礎的データを得ることができた。
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