ＣｌＣ―３のアイソフォーム間における機能的差異に関する分子生理学的研究

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 24590291
• Research Institution: National Institute for Physiological Sciences
• Principal Investigator: 岡田 俊昭 生理学研究所, 細胞器官研究系, 准教授 (00373283)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 生理学 / イオンチャネル

Outline of Annual Research Achievements

ClCチャネル/トランスポータファミリーに属するClC-3は約15年前にクローニングされ、以降多くの研究・解析が行われてきたが、チャネルとしての機能については不明な点が多い。ClC-3にはそれぞれ異なるN末、C末アミノ酸配列を持つa-fの6つのアイソフォームが存在すると考えられているが、アイソフォーム間の機能的な差異や、その差異が生じるメカニズムについても多くが不明のままである。本研究はa-dの4つのアイソフォームにおいてN末、C末の違いがClC-3の機能をどのように制御するのか明らかにすることを目的としている。アイソフォームｄ（ClC-3d）は我々が新規にクローニングした分子で、これまでに比較的実験報告の多いClC-3a分子と比べた場合、C末のアミノ酸配列が異なっている。２５年度までは、この新規分子であるClC-3dをClC-3aと比較しながら実験を進めた。その結果、細胞膜における電流の性質については顕著な差異が無いが、それぞれのタンパクの細胞内局在パターンは異なることを示した。従ってClC-3dと-3a に見られるC末アミノ酸配列の差異は、それぞれのタンパクの細胞内局在の制御に関わるものと考えられる。成果は２６年度に論文として発表した(昨年度の報告書に記載済み)。細胞内局在の違いはClC-3aと、ClC-3aと比較した場合にＮ末のアミノ酸配列がそれぞれ異なるClC-3b, -cの間でも観察される。２６年度はアイソフォーム間の細胞内局在に違いが生じるメカニズムを調べるために、ミュータント分子の作成を行った。ClC-3dとClC-3aのＣ末アミノ酸キメラ分子及びClC-3b, -cのＮ末アミノ酸デリーション分子を数種類ずつ作成した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本研究課題はClC-3のアイソフォーム間の機能的な差異や、その差異が生じるメカニズムについて調べることを目的としている。これまでに成果として、我々が新規にクローニングしたアイソフォーム、ClC-3dに関する論文が２６年度中に、Cell Physiol Biochem誌上に掲載された。この論文で示したように、C末アミノ酸配列の異なる２つのアイソフォームについてその機能的な差異を調べ、そこに一定の結論を得ることができたことで本研究課題の目的の一部について達成できたと考えている。しかし、ClC-3のミュータント分子を用いた解析については、予定していた種類のクローンを２６年度末頃にほぼ作成したもののその解析はまだ進んでおらず、全体的に見れば計画より遅れている。

Strategy for Future Research Activity

これまでの実験結果から、ClC-3の各アイソフォームのN末、 C末アミノ酸配列の差異は、それぞれのタンパクの細胞内局在に反映されると考えられる。よって今後はＮ末、Ｃ末に導入した変異によってClC-3分子の局在がどう変化するのかという点について細胞内小器官マーカーを用いながら観察し、各アイソフォームを特徴づけているＮ末、Ｃ末アミノ酸配列において機能的に重要な部位を特定する実験を行っていく。その過程で必要になれば、新たな変異クローンを作成する。また、他のタンパク質との結合が細胞内局在に働いていると考えられる為、導入した変異によってそれらの結合に変化が生じる可能性について免疫沈降等の実験を行って調べたい。

Causes of Carryover

この研究ではClC-3チャネルのミュータント分子を複数作成することを計画しているが、予定していた幾つかのミュータント分子の作成が困難であった。実験方法を再検討し一部改変した結果、昨年度末になってミュータント分子作成がようやく進んだが、全体として時間を取られてしまい予定通りに計画が進まなかったことが次年度使用額が生じる原因となった。また、26年度は研究室で行っている中心的な研究課題に特に時間を割かなければならない状況だったことも原因の一つとなった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

経費の多くは今後も実験のために使用したい。既に作成したミュータント分子の機能を検証するための細胞小器官に対するマーカー試薬や、タンパク解析のためのウエスタンブロッティング用の試薬・製品を購入する必要がある。また必要に応じてさらにミュータント分子を作成する作業行う。そのために必要な分子生物学的試薬類も購入する。また未使用金の一部は成果の発表の為に使用したい。