2014 Fiscal Year Annual Research Report
細胞モデルを用いたミオシン１分子計測の試み：より生体に近い状態での解析を目指して
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24590312
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| Research Institution | Gunma Prefectural College of Health Sciences |
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Principal Investigator |
石川 良樹 群馬県立県民健康科学大学, 看護学部, 教授 (20212863)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中村 彰男 群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (30282388)
本多 元 長岡技術科学大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (20192742)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | アクチン / ミオシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
モータータンパク質ミオシンは、アクチン繊維をレールとして滑り運動を行い、細胞における主要な力発生源となっている。アクチン繊維は細胞内で種々のアクチン結合蛋白質と結合し、ストレスファイバー、接着斑、膜裏打ち、フィロポディア、ラメリポディア等、さまざまな高次構造複合体を取る。我々は高次構造に含まれる生成タンパク質の再構成系を用いて、アクチン結合蛋白質がミオシン滑り運動に影響を及ぼす事を報告してきた。本研究では、(1)アクチン高次複合体の単離、及び(2)細胞モデルを利用して、再構成系よりも生体に近い系を確立しようとするものである。
(1)界面活性剤処理、ファロトキシンによるアクチン安定化、細胞破砕と低速遠心法を用いて、神経細胞からフィロポディア様構造の単離を行った。高濃度ニトロセルロースでこの構造物を基板上に固定し蛍光標識ビーズミオシンを種々の条件で作用させたが、ビーズが構造物に結合せず、滑り運動は観察できなかった。またミオシンを基板上に固定したフローチェンバーにおいても、構造物は滑り運動を示さなかった。アクチンとミオシンの結合を阻害する因子が結合している可能性があり、この単離法は滑り運動解析系には適さないものと思われる。
(2)カバーグラス上の神経細胞を用いてフローチェンバーを作成し、ファロトキシン存在下、高濃度界面活性剤処理をして脱膜後、アクチン構造を顕微鏡観察したところ、アクチン細胞骨格が保持されていた。さらに、チェンバー内溶液を数回入れかえた後も、アクチン構造が壊れない事が確認できた。このチェンバーに蛍光標識ミオシンを導入したところ、アクチン繊維への結合が観察された。この系はアクチンの脱重合を阻害しながら脱膜しただけなので、生体に近いミオシン滑り運動解析に有望だと思われる。
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