• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to project page

2012 Fiscal Year Research-status Report

ヘムオキシゲナ-ゼ(HO)反応における電子の授受およびHO内部の電子伝達機構

Research Project

Project/Area Number 24590366
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Research InstitutionKurume University

Principal Investigator

野口 正人  久留米大学, 医学部, 教授 (10124611)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 佐藤 秀明  久留米大学, 医学部, 准教授 (60271996)
杉島 正一  久留米大学, 医学部, 准教授 (30379292)
東元 祐一郎  久留米大学, 医学部, 准教授 (40352124)
原田 二朗  久留米大学, 医学部, 講師 (10373094)
Project Period (FY) 2012-04-01 – 2015-03-31
Keywords生理的ヘム分解 / ヘムオキシゲナーゼ / シトクロムP450還元酵素 / タンパク質間の電子伝達 / 酸素分子の活性化 / 一酸化炭素 / ビリベルジン / ビリルビン
Research Abstract

ヘムオキシゲナーゼ(HO)は,本来ヘム蛋白質ではないが,NADPH-シトクロムP450還元酵素(CPR)からの電子を利用して, 基質であるヘムが自触的に酸素分子を活性化し,3段階の酸素添加反応によってヘムを開環し,ビリベルジン・鉄・COを生成する。本研究では, CPRからHOへの電子の受け渡し機構およびその電子が基質であるヘムに到達するHO内部の径路を明らかにすることを目的とする。
1.我々は表面プラズモン共鳴法を用いた結合実験とコンピュ-タ-モデリングから,CPR/HO-1複合体の推定構造を得た。この構造およびHO活性測定実験から, HO-1のK149,K153およびR185がCPRとの相互作用に重要であると結論した。しかしながら最近CPRにはドメイン単位での構造的揺らぎがあることが知られ、最も開いた状態の完全ヒンジ短縮型CPR(△TGEE)から、より開きの程度が低い一連の部分ヒンジ短縮型CPRはそれぞれ特有のopen conformation をとる可能性がある。よってこれらのヒンジ短縮型CPRとヘム-HO複合体を結晶化し構造を決定する。
2. 最近、我々はHOのNMR緩和分散測定を行い、ヘム結合時にヘム結合部位から遠く離れたタンパク質表面領域の7個のアミノ酸残基(V73, L77, Y78, F79, L83, H84及びR85)に構造の揺らぎが観られた。これらの変異体のHO活性をCPRを用いて調べたところ、F79Aに著しい活性の低下が見られた。HOの電子伝達系が部分的に損なわれたために、F79Aの活性低下がもたらされたと推察されたので、この変異体と新たに作製したF79Lを詳細に解析する。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1.最も開いた状態のヒンジ短縮型CPR(△TGEE)は, ヘム-HO結合体と強固な複合体を形成した。この複合体については、既に結晶が得られ、現在その構造を解析しているところである。
2.野生型HOとF79AおよびF79L変異体のsingle turnover解析ならびに酵素活性測定の結果を比較すると、F79Aのみで野生型よりもヘム分解活性が低下し、その原因が電子伝達系の異常にあると考えられた。また結晶構造解析から、F79A変異が、CPRとの相互作用に重要であるR185の配向に影響を与えていることが分かった。一方、F79L変異体では、R185への影響はほとんど見られなかった。そこで、表面プラズモン共鳴法解析によってCPRと変異体の相互作用を調べたところ、どちらの変異体も野生型と同等のCPRとの親和性を示した。これらの結果から、R185はCPRとの相互作用だけでなく、CPRからの電子の伝達にも関与している可能性が示唆された。

Strategy for Future Research Activity

1.一連のヒンジ短縮型CPRについて、次のような生化学的検討を行う。①ゲル濾過:野生型CPR (wCPR, closed formに大きく傾いている) とヘム-HO結合体は分離して溶出されるが, CPR(△TGEE)はヘム-HOとの複合体として溶出される(強く結合している)。一連のヒンジ短縮型CPRがゲル濾過上HOとどのような挙動をとるのかを調べる。②表面プラズモン共鳴法:アポHOはwCPRともCPR(△TGEE)とも会合しない(CPRとの相互作用にはヘム-HO結合体の立体構造が必須)。一連のヒンジ短縮型CPRについてヘム-HO結合体との解離定数(Kd)を測定する。③EDCによる架橋実験:CPR(△TGEE)はHOと堅く架橋される。他のヒンジ短縮型CPRについても同様な検討をする。
2. NMRによる緩和分散によって, ヘム結合部位から遠く離れたタンパク質表面領域の7個のアミノ酸残基(V73, L77, Y78, F79, L83, H84及びR85)に構造の揺らぎが観られた。これらの変異体のHO活性をCPRを用いて調べたところ, F79Aに加えて、Y78A、 L83A及びR85Aの変異体で著しい活性の低下が見られた。ベルドヘム段階で反応がほぼ停止する変異体も含まれていた。この結果は, HO蛋白表面に位置するアミノ酸残基が CPRとの結合及び電子伝達に深く関与していることを窺わせる。よって, この4つの変異体について一連の生化学的解析を行い、CPRからの電子の受け取り口であるHO側の残基を特定する。さらにその残基がFMNから電子を受け取るのかあるいはFADからなのかを, FMN欠失CPRおよびFAD欠失CPRを用いて決定する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

平成24年度の残金約20万円と今年度の配分金120万円を合わせても、140万円である。この金額は通常の実験試薬の購入及び学会研究打ち合わせ等で充分消費できるので、昨年と同様に日常的な研究費として使用する予定である。

  • Research Products

    (25 results)

All 2012 Other

All Journal Article (4 results) (of which Peer Reviewed: 3 results) Presentation (21 results)

  • [Journal Article] Role of proline in heme regulatory motifs of heme oxygenase-22012

    • Author(s)
      R. Tsurusawa, S. Koga, Y. Higashimoto, M. Noguchi, and H. Sakamoto
    • Journal Title

      Peptide Science

      Volume: 48 Pages: 159-160

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Identification of essential amino acid residues involved in the interaction of heme oxygenase-1 with caveolin-12012

    • Author(s)
      J. Taira, M. Sugishima, Y. Kida, E. Oda, M. Noguchi, and Y. Higashimoto
    • Journal Title

      Peptide Science

      Volume: 48 Pages: 35-38

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Discrimination between CO and O2 in heme oxygenase: Comparison of static structures and dynamic conformation changes following CO photolysis2012

    • Author(s)
      M. Sugishima, K. Moffat, M. Noguchi
    • Journal Title

      Biochemistry

      Volume: 51 Pages: 8554-8562

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A seventh bacterial chlorophyll driving a large light-harvesting antenna2012

    • Author(s)
      J. Harada, T. Mizoguchi, Y. Tsukatani, M. Noguchi, and H. Tamiaki:
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 6 Pages: 671

    • DOI

      DOI:10.1038/srep00671

  • [Presentation] ヘムオキシゲナーゼのヘム結合の熱力学:置換等温滴定熱測定による精密解析2012

    • Author(s)
      小松英幸、奥田真孝、山本真平、東元祐一郎、野口正人、坂本寛
    • Organizer
      第85回 日本生化学会
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      20121214-20121216
  • [Presentation] 表面プラズモン共鳴法によるヘムオキシゲナーゼ-2とシトクロムP450還元酵素の相互作用の検討2012

    • Author(s)
      和田翔太、東元祐一郎、野口正人、末田慎二、小松英幸、坂本寛
    • Organizer
      第85回 日本生化学会
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      20121214-20121216
  • [Presentation] リガンド結合型ヘム-ヘムオキシゲナーゼの光解離後の構造変化から推察されるO2とCOの識別機構2012

    • Author(s)
      杉島正一、Moffat Keith、野口正人
    • Organizer
      第85回 日本生化学会
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      20121214-20121216
  • [Presentation] ヘムオキシゲナーゼ分子表面に存在するF79の変異導入解析から見出された電子伝達機構2012

    • Author(s)
      原田二朗,原田英里砂,東元裕一郎,佐藤秀明,杉島正一,平 順一,福山恵一,菅瀬謙治,野口正人
    • Organizer
      第85回 日本生化学会
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      20121214-20121216
  • [Presentation] 揺らぎが制御するヘム分解酵素反応の遠位効果2012

    • Author(s)
      原田英理砂、杉島正一、原田二朗、野口正人、福山恵一、菅瀬謙司
    • Organizer
      第35回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      20121211-20121214
  • [Presentation] ヘムオキシゲナーゼ-2由来HRMペプチドのPro残基における機能解析2012

    • Author(s)
      鶴澤怜也、古賀真也、東元祐一郎、野口正人、坂本寛
    • Organizer
      第49回 ペプチド討論会
    • Place of Presentation
      鹿児島
    • Year and Date
      20121207-20121209
  • [Presentation] Genetic analysis of the green sulfur bacterium Chlorobaculum limnaeum2012

    • Author(s)
      J. Harada, T. Mizoguchi, Y. Tsukatani, M. Noguchi, and H. Tamiaki
    • Organizer
      Second International Symposium on Biosynthesis of Tetrapyrroles
    • Place of Presentation
      Kusatsu, Japan
    • Year and Date
      20121130-20121202
  • [Presentation] Protein motions and CO migration following CO photolysis in haem oxygenase2012

    • Author(s)
      M. Sugishima, K. Moffat, M. Noguchi
    • Organizer
      Asian Crystallographic Association '12
    • Place of Presentation
      Adelaide, Australia
    • Year and Date
      20121130-20121202
  • [Presentation] ヘムオキシゲナーゼの温度依存的構造変化と酵素反応に与える影響2012

    • Author(s)
      杉島正一、Moffat Keith、野口正人
    • Organizer
      平成24年度日本結晶学会年会
    • Place of Presentation
      仙台
    • Year and Date
      20121022-20121024
  • [Presentation] Protein motions and CO migration following CO photolysis in heme oxygenase2012

    • Author(s)
      M. Sugishima, K. Moffat, M. Noguchi
    • Organizer
      第50回日本生物物理学会年会
    • Place of Presentation
      名古屋
    • Year and Date
      20120922-20120924
  • [Presentation] ヘム結合時にヘムオキシゲナー ゼの分子表面で揺らぐアミノ酸残基F79 の変異体解析から見出される知見2012

    • Author(s)
      原田二朗,原田英里砂,東元裕一郎,佐藤秀明,杉島正一,平 順一,福山恵一,菅瀬謙治,野口正人
    • Organizer
      第6回 バイオ関連化学シンポジウム
    • Place of Presentation
      札幌
    • Year and Date
      20120906-20120908
  • [Presentation] Role of structural fluctuation in enzyme catalysis of heme oxygenase 12012

    • Author(s)
      Harada, M. Sugishima, J. Harada, M. Noguchi, K. Fukuyama, and K. Sugase
    • Organizer
      25th International conference on Magnetic resonance in biological systems
    • Place of Presentation
      Lyon, France
    • Year and Date
      20120819-20120824
  • [Presentation] Characterization of the novel monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) synthase, found in green sulfur bacteria, reveals mechanisms of chlorosome biogenesis2012

    • Author(s)
      S. Masuda, J. Harada, M. Noguchi, and H. Ohta
    • Organizer
      14th International Symposium on Phototrophic Prokaryotes
    • Place of Presentation
      Porto, Portugal
    • Year and Date
      20120805-20120810
  • [Presentation] 新規色素バクテリオクロロフィル fは緑色硫黄細菌の生体内でアンテナ系クロロソームを駆動する2012

    • Author(s)
      原田二朗、溝口 正、塚谷祐介、野口正人、民秋 均
    • Organizer
      第20回光合成の色素系と反応中心に関するセミナー
    • Place of Presentation
      豊中
    • Year and Date
      20120630-20120701
  • [Presentation] 緑色硫黄細菌Chlorobaculum tepidumのC8位ビニル還元酵素遺伝子変異体の色素組成から考察されるバクテリオクロロフィル生合成経路2012

    • Author(s)
      原田二朗、溝口 正、吉冨太一、野口正人、民秋 均
    • Organizer
      第20回光合成の色素系と反応中心に関するセミナー
    • Place of Presentation
      豊中
    • Year and Date
      20120630-20120701
  • [Presentation] The role of amino acids on the surface of heme oxygenase in its catalysis: An analysis of F79A mutant2012

    • Author(s)
      J. Harada, E. Harada, Y. Higashimoto, H. Sato, M. Sugishima, J. Taira, K. Fukuyama, K. Sugase, and M. Noguchi
    • Organizer
      7th International Congress on Heme Oxygenase and Rated Enzymes
    • Place of Presentation
      Edinburgh, Scotland, UK
    • Year and Date
      20120528-20120601
  • [Presentation] Reduction of CO-bound alpha-verdoheme-heme oxygenase-1 complex by NADPH-cytochrome P450 reductase2012

    • Author(s)
      H. Sato, Y. Higashimoto, H. Sakamoto, M. Sugishima, J. Harada, and M. Noguchi
    • Organizer
      7th International Congress on Heme Oxygenase and Rated Enzymes
    • Place of Presentation
      Edinburgh, Scotland, UK
    • Year and Date
      20120528-20120601
  • [Presentation] NMR解析で見出されたヘムオキシゲナーゼ表面に局在するF79の機能的役割2012

    • Author(s)
      原田二朗,原田英里砂,東元裕一郎,杉島正一,佐藤秀明,平 順一,福山恵一,菅瀬謙治,野口正人
    • Organizer
      平成24年度生化学会九州支部例会
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      20120526-20120527
  • [Presentation] 表面プラズモン共鳴法を用いたヘムオキシゲナーゼ-2 変異体とシトクロムP450 還元酵素との相互作用解析2012

    • Author(s)
      和田翔太、福島祐也、東元祐一郎、野口正人、末田慎二、小松英幸、坂本寛
    • Organizer
      平成24年度生化学会九州支部例会
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      20120526-20120527
  • [Presentation] ヘムオキシゲナーゼ-1 とヘムとの結合における静電的相互作用の熱力学的解析2012

    • Author(s)
      山本真平、奥田真孝、山下耕平、東元祐一郎、野口正人、小松英幸、坂本寛
    • Organizer
      平成24年度生化学会九州支部例会
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      20120526-20120527
  • [Presentation] ヘム定量に用いるセンサー蛋白質における蛍光色素の選定およびその導入箇所の検討

    • Author(s)
      坂東大輝、古賀真也、山崎一樹、東元祐一郎、野口正人、小松英幸、坂本寛
    • Organizer
      第49回化学関連支部合同九州大会
    • Place of Presentation
      北九州

URL: 

Published: 2014-07-24  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi