2012 Fiscal Year Research-status Report
超高頻度突然変異誘発型ネズミマラリア原虫の創成とその次世代分子マラリア学への応用
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24590501
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
平井 誠 群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50326849)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 熱帯熱マラリア原虫 / ミューテーター |
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| Research Abstract |
熱帯熱マラリア原虫ミューテーターは、ラギング鎖のDNA複製酵素であるポリメラーゼdeltaの校正機能欠損を利用して作成する。この酵素はマラリア原虫を含む幅広い生物種において一次構造がよく保存されており、校正機能にとって必須なアミノ酸２箇所が酵母遺伝学研究により同定されている。P. falciparum３Ｄ７株（ゲノム解析が完了している）のDNA複製酵素deltaにおいて、相当するアミノ酸２カ所（D308, E311）をsite-directed mutagenesisによりアラニンに置換した遺伝子断片を調製した。P. falciparumに外来遺伝子を導入する場合、ネズミマラリア原虫と大きく異なる点は、「２重交叉により内在遺伝子を外来遺伝子で入れ換えることが極めて困難な点」である。従ってP. falciparumの場合、ほとんどが「一重交叉による外来遺伝子の挿入」が一般的である。しかし、挿入された遺伝子断片は容易に染色体から脱落し野生型原虫に戻りやすい。一方、二重交叉によって内在性遺伝子と置き換えられた外来遺伝子断片は、ピリメサミンがなくてもゲノム内に安定して保たれる。ごく最近、熱帯熱マラリア原虫において遺伝子置換の新手法が報告されたことから、この手法を用いて変異型ポリメラーゼdeltaを保持する熱帯熱マラリア原虫作成のための予備実験を行い準備が完了した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
熱帯熱マラリア原虫ミューテーターを作成するにあたり、当初は従来の二重交叉法を計画していた。この方法は、熱帯熱マラリア原虫では成功例が極めて少なく本研究課題の成否を決めるキーポイントである。最近、熱帯熱マラリア原虫において高効率な遺伝子置換法が報告されたことから、本研究課題において目的とする原虫作成のためにその方法を用いることにした。予備実験として、その方法が熱帯熱マラリア原虫で実際に機能しうるかを検証したところ、確かに機能することが明らかになった。本研究計画では、24年度において従来法により目的とした原虫を作成することであったが、新たな手法を取り入れるための確認実験を行い、実際にその手法を熱帯熱マラリア原虫に適用可能であることを確認できた点は、次年度において本手法を用いて実際に目的とした原虫作成を行う上で、極めて重要なポイントをクリアできたと言える。以上のことから、本研究課題は予定通り進んでいると結論した。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度で行った予備実験結果を踏まえ、今年度は突然変異が高頻度に発生するマラリア原虫ミューテーターを作成する。作成したミューテーターを継代培養を行い、継代の過程でミューテータのゲノム内に変異が高効率で発生していることを次世代シーケンサーにより確認する。その結果を踏まえ、ミューテーター原虫の培養系に種々の抗マラリア薬を添加することにより、薬剤耐性原虫の単離を試みる。薬剤耐性原虫のゲノム解析および原因遺伝子同定を最終年度にあたる次年度に行うことで、本研究課題の目的を達成する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
当初の計画では、前年度（24年度）において目的とした原虫を作成する予定であったが、原虫作成のための技術革新が報告され、前年度はその技術の検証に研究費を費やし、使用金額は予定使用金額を下回った。その差額は、25年度において新技術を用いた原虫作成のために使用する。また、今年度分の研究費は、当初の研究計画通り、作成した原虫のゲノム解析および薬剤耐性原虫単離のために使用する。
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Research Products
(7 results)
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[Journal Article] Resistance to Malaria by Enhanced Phagocytosis of Erythrocytes in LMP7-deficient Mice.2013
Author(s)
Duan X, Imai T, Chou B, Tu L, Himeno K, Suzue K, Hirai M, Taniguchi T, Okada H, Shimokawa C, Hisaeda H.
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Journal Title
PLoS One.
Volume: 8
Pages: e59633
DOI
Peer Reviewed
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