2013 Fiscal Year Research-status Report
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24590538
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| Research Institution | Chubu University |
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Principal Investigator |
宮田 茂 中部大学, 応用生物学部, 准教授 (90314913)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡部 昭延 中国学園大学, 現代生活学部, 教授 (20093677)
成谷 宏文 香川大学, 医学部, 助教 (30452668)
森山 龍一 中部大学, 応用生物学部, 教授 (60191061)
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| Keywords | ウェルシュ菌 / 糖鎖分解酵素 / 病原性 |
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| Research Abstract |
ウェルシュ菌の感染時に重要な働きをすることが示唆されている糖鎖分解酵素の性質はほとんど明らかにされていない。そこで、本菌の侵襲性に大きく影響を与えると考えられるヒアルロニダーゼや各種糖鎖分解酵素の性質を明らかにすることを試みた。
ヒアルロニダーゼ遺伝子としてCanardらによりnagHが報告されており、その後のゲノムプロジェクトによりウェルシュ菌13株の染色体上にはnagI, nagJ, nagK及びnagLの計5種類が存在することが明らかとなった。昨年度、組換えウェルシュ菌によりNagH及びNagJを過剰発現させ、これらの酵素を精製し基質特異性及び、同様に発現・精製したウェルシュ菌のβ-ガラクトシダーゼ（BgaA）及びシアリダーゼ（NanI、NanJ）との協同作用を調べた。また、NagH及びNagJには、ヒアルロン酸分解酵素活性が全く検出されなかったので、真のヒアルロニダーゼを検索した結果、新規リアーゼ（Hyl）を見出し、発現・精製に成功した。
今年度は、残りのNagI, NagK, NagLの発現系を構築し、組換えウェルシュ菌により過剰発現させ、精製を試みた。NagLはNagH, Jと同様な方法で発現することに成功したが、NagI及びNagKは培地中にほとんど遊離しなかった。これらの酵素はC-末端領域にLPxTG motifを有し、細胞壁にアンカーリングされると考えられたので、C-末端領域をそれぞれ37残基及び36残基欠失させたrNagI及びrNagKの発現系を構築したところ、大量に培地中に遊離し、精製に成功した。精製した酵素はすべてpNP-GlcNAcを加水分解したので現在カイネティクス解析を行っている。また、Hylの部位特異的変異体の発現系を構築した。Y282Fのヒアルロニダーゼ活性が消失していたことから、Y282が活性残基であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、ウェルシュ菌感染時における糖鎖分解酵素の役割を解明することを目的として、糖鎖分解酵素を発現・精製し、基質特異性、糖鎖結合特性を解析すると共にそれらの協同作用を明らかにすることを目指している。当初から計画どおり研究が進まないことを考慮して、各課題を並行して進めることができるように研究を計画している。前年度は、平成25年度、平成26年度に実施を計画していた課題を前倒しし、NagHの基質特異性解析や構造解析のための触媒ドメイン発現系の構築に成功するとともに、真のヒアルロニダーゼである新規リアーゼ（Hyl）の発現と一部機能解析に成功した。今年度は、平成24年度の実施計画で示したNagI、NagK、NagLの発現・精製に成功し、さらにHylの部位特異的変異株を作製しヒアルロニダーゼ活性が消失することを示した。それらのことから、全体的にはおおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の研究計画どおりNagI, NagK, NagLのカイネティクス解析を行う。なお、NagHとNagJについてはすでに解析済みである。また、すべてのNagについてヒト型分枝糖鎖に対する基質特異性を決定する。一方で、NagH全長の結晶構造解析では未だ分解能の高い結晶が得られていないので、平成24年度に作製したNagHの触媒ドメインについても結晶化を試みる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本研究で遂行のために重要な機器である振盪培養器（タイテック振とう機HB）が故障したため、学会発表を見送り、そのために計上していた旅費を当該機器の修理費に充てたために「次年度使用額（B-A）」が生じた。
平成26年度には、当初計画どおり研究を続行するため、使用計画に大きな変更はない。「次年度使用額（B-A）」は、消費税増税及び物価上昇に伴い、物品費が当初計画以上に必要になると考えられるため、物品費に充当する。
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Research Products
(3 results)
